[发明专利]重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用

说明书

本发明涉及重组人源化胶原蛋白及其制备方法与应用。本发明人源化胶原蛋白(rHLC)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列作为核心单元进行3‑25个重复串联形成一系列不同分子量的人源化胶原蛋白分子。本发明的rHLC分子序列来自于人I型胶原蛋白，具有极大的水溶性和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且促增殖作用显著；在大肠杆菌宿主内可以高效表达；发酵工艺培养基成本低廉成分明确，发酵周期较短，控制简单，易于工艺放大；纯化方法操作简单，成本低，效果好，工艺稳定，纯化后的纯品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准，生产工艺可满足产业化生产需求，可应用于医美类化妆品或者功能性化妆品。

技术领域

本发明属于基因工程、蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白分子(recombinant human like collagen，简称rHLC)的表达及纯化制备方法。

背景技术

胶原蛋白是人体中含量最为丰富的蛋白质，占人体总蛋白质的25-30％，主要存在于人体的皮肤、骨骼、软骨、牙齿、肌腱、韧带，是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，起着支撑器官，保护机体的功能。胶原蛋白种类很多，常见的类型包括：I型、II型、III型、V型和XI型，其中I型胶原蛋白主要存在于皮肤、肌腱等组织中，是含量最多的胶原蛋白类型。胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性(促进伤口恢复、凝血等)，因此在食品、医疗、组织工程、化妆品中有着非常广泛的应用。目前应用最为广泛的胶原蛋白是I型胶原蛋白。

目前应用的胶原蛋白主要来自于动物组织的提取或人胶原(胎盘组织提取、骨骼等)，其中通过动物组织提取胶原是最主要的手段，成本也较低，但是通过该方法获得的胶原蛋白一般水溶性较差、具有潜在的病毒传染性风险、免疫原性较高、胶原产品质量控制难度高等缺点。通过基因工程的手段制备人源化胶原蛋白分子则可以规避这些缺点，但是天然的胶原蛋白分子过大，无法或很难通过基因工程手段直接生产，而通过生产与天然胶原蛋白序列相似、分子量更小的人源化胶原蛋白分子则是在技术上更为可行。市场上已有一些重组胶原蛋白产品，而现有的产品都是针对各自产品特点需要，在人胶原蛋白序列的基础上进行重新构建设计的，但这些设计并不能满足极大的水溶性和亲水性、良好的保湿性和吸湿性等特殊性能需求，同时还需要满足产业化制备的需要。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供了一种全新设计的重组人源化胶原蛋白分子(recombinant human like collagen，简称rHLC)的表达及纯化制备方法。具体涉及到：1、rHLC的分子设计以及重组大肠杆菌表达菌株的构建；2、rHLC发酵工艺开发；3、rHLC纯化工艺开发。本发明所设计的人源化胶原蛋白分子在大肠杆菌宿主内具有较高的产量，并且确定了简单方法获得高品质纯品的工艺。

本发明目的之一在于提供一种衍生自人I型胶原蛋白的人源化胶原蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为RepA。该序列可以作为核心单元进行重复串联形成一系列不同分子量的人源化胶原蛋白分子，优选的重复个数包括3-25个，更优选为10-20，最优选10-15个。不同重复个数的部分信息如下表：

本发明目的之二在于提供一种用于携带和表达所述重组人源化胶原蛋白基因的表达载体，所述载体应具备较强的转录启动子、较高的拷贝数等特点，如常见的pET载体等。

本发明目的之三在于提供一种用于所述rHLC重组表达质粒表达的宿主，如BL21(DE3)、BL21 AI、Rosetta(DE3)、Transetta(DE3)等。

本发明之四在于提供一种表达rHLC大肠杆菌的发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤：

将种子液按照1-10％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；

设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45％之间；