[发明专利]一个呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合及其应用

说明书

本发明公开了一个呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合及其应用。利用发明的建库的引物组合进行呼吸道病原体的纳米孔测序建库，该方法只需要2步PCR扩增和接头连接，就可以达到建库的目的，其中在第二步PCR扩增时，只需要补充引物而无需添加酶，操作步骤简单；具有快速建库的特点、进而能够实时测序和分析；同时检测样本中的细菌宏基因组和真菌宏基因组。

技术领域

本发明涉及呼吸道病原体检测技术领域，更具体地，涉及一个基于纳米孔测序建库的引物组合及其应用。

背景技术

呼吸道感染是临床常见疾病，也是目前危害大众健康最为严重的疾病之一。呼吸道感染可由细菌、真菌等多种病原体引起，病原体检测是呼吸道感染精准治疗的基础，也是疾病得以有效防控的前提。

传统的病原检测方法包括涂片镜检，免疫学检测，微生物培养，分子检测。然而这些方法每次只能检测到一种或有限的病原体，其操作过程繁琐、检测时间较长，此外培养还存在阳性率低的缺点。

现有的二代测序技术可以用于不明原因病原微生物的鉴定，如中国专利CN111394486A“基于宏基因组测序的儿童感染性疾病病原检测及鉴定方法”，但由于二代测序读长短，增加了判定病原的难度；测序仪投入大，测序完成后只能在高性能计算设备上进行数据分析；操作步骤多，从样本到结果的流转周期长，不利于病原的快速和准确鉴定。

中国专利CN111041130A检测病原体的组合物、试剂盒及方法，利用单通道多重实时荧光PCR技术检测多种病原体，但仅能针对特定的15种病原体，而无法对未知病原体进行检测。

可见，本领域仍亟需一种快速、准确、全面的病原体检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一个基于纳米孔测序建库的引物组合及其应用，通过PCR扩增技术提高病原体核酸在文库中的占比，达到快速鉴定的效果，结合纳米孔测序平台的长读长特性增加病原识别的准确性，从而实现快速、准确、实时的病原体鉴定。

本发明的第一个目的是提供一个基于纳米孔测序建库的引物组合。

本发明的第二个目的是提供一种所述的引物组合在纳米孔测序建库中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种所述的引物组合在制备纳米孔测序建库试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一个基于纳米孔测序建库的试剂盒。

本发明的第五个目的是提供一个基于纳米孔测序建库的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护一个呼吸道病原体的纳米孔测序建库的引物组合，包括序列(1)到序列(5)，每条序列从5’端到3’端均由a段序列、b段序列和c段序列组成；

其中序列(1)到序列(5)的b段序列的一致，其序列的核苷酸如SEQ ID NO：1～108任一所示；

序列(1)到序列(5)的c段序列的核苷酸分别依次如SEQ ID NO：109～113所示；

序列(1)、序列(3)和序列(4)的a段序列为所选用的PCR条码试剂盒中条码引物中的正向引物的3’端的24个碱基的反向互补序列；

序列(2)和序列(5)的a段序列为所选用的PCR条码试剂盒中条码引物中的反向引物的3’端的24个碱基的反向互补序列。

优选地，所述PCR条码试剂盒为Oxford nanopore technology公司的SQK-PBK004试剂盒，序列(1)、序列(3)和序列(4)的a段序列核苷酸如SEQ ID NO：114所示，序列(2)和序列(5)的a段序列核苷酸如SEQ ID NO：115所示。