[发明专利]一种人甲状旁腺激素真核表达重组质粒载体及其构建方法

权利要求书

1.一种人甲状旁腺激素真核表达载体重组质粒，其组成部件特征为：目的基因为人甲状旁腺激素（PTH1-84aa)基因（SEQ ID NO. 1）；质粒载体为PHY-810，载体原件：CMV-MCS-3xFlag-SV40-Neo；双酶切位点为BamHI酶切位点和XhoI酶切位点，重组质粒载体大小为5888bp。

2.根据权利要求1所述的人甲状旁腺激素真核表达载体重组质粒,其构建方法特征在于包括如下步骤：（1）人工合成人甲状旁腺激素（PTH1-84aa)基因（SEQ ID NO. 1）；（2）以所合成的PTH基因为模板，设计引物，P1含有BamHI酶切位点,P2含有XhoI酶切位点；（3）经PCR扩增PTH基因片段；（4）PCR扩增PTH基因片段用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后,与经相同酶切的载体PHY-810连接；（4）将连接好的表达载体转化感受态细菌,涂板筛选、酶切测序鉴定，得到人PTH基因真核表达载体重组质粒（PHY-PTH）。

3.根据权利要求1所述的人甲状旁腺激素真核表达载体重组质粒，其结构特征在于人甲状旁腺激素基因克隆位点位于BamHI—XhoI之间，在不增加重组质粒载体bp数量的前提下，避开N端活性功能区，在C端连接flag-tag,使PTH与3xFlag融合表达，有利于提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性，提高PTH功效和延长其作用时间。

4.根据权利要求2所述的人甲状旁腺激素真核表达载体重组质粒构建方法，其特征在于基于目的基因序列的引物设计，分别在上游引物的5’端插入一个BamHI酶切位点,在下游引物的5’端插入一个XhoI酶切位点：

p1(BamH I)：CTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGGGTGTGTGTATGTG；

p2(Xho I)：CATGGTCTTTGTAGTCCTCGAGCTGGGATTTAGCTTTAGTTAATACAT。

5.根据权利要求2所述的人甲状旁腺激素真核表达载体重组质粒构建方法，进行PCR扩增获得目的基因，其特征在于PCR扩增条件为：预变性94度，变性98度，2min，变性98度，10s，退火62度，30s，延伸68度，3min，30个循环，最后延伸68度，5min。

6.根据权利要求2所述的人甲状旁腺激素真核表达载体重组质粒构建方法,，其特征在于所述PTH片段与PHY-810载体的体积比=（载体长度x0.02）/（目的片段长度x0.04）。

7.根据权利要求1所述的人甲状旁腺激素真核表达载体重组质粒，其功效在于作为基因药物用于治疗甲状旁腺功能减退，本发明所提供的PHY-PTH作为基因治疗载体，可以使甲状旁腺外细胞表达PTH，从而起到替代甲状旁腺分泌PTH的治疗作用。