[发明专利]一种人甲状旁腺激素真核表达重组质粒载体及其构建方法

说明书

本发明涉及基因药物领域，具体提供了一种人甲状旁腺激素真核表达重组质粒载体及其构建方法。该构建方法包括如下步骤：人工合成甲状旁腺激素（hPTH1‑84aa)基因（SEQ ID NO.1）,经PCR扩增获得甲状旁腺激素基因片段，用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切PCR产物后,与经相同酶切的真核表达载体质粒PHY‑810连接,将连接好的表达载体转化感受态细菌,涂板筛选得到人PTH基因真核表达重组质粒载体（图1：PHY‑PTH）。本发明所构建的真核表达重组质粒载体使细胞高表达PTH，可用于针对甲状旁腺功能减退症和骨质疏松的基因治疗。

技术领域

本发明涉及基因药物领域，特别涉及针对甲状旁腺功能减退基因治疗的重组质粒载体构建。

背景技术

甲状旁腺素是由人甲状旁腺分泌的活性多肽类激素，其主要生理功能是通过调节骨细胞和肾细胞维持血钙平衡，刺激肾对钙的重吸收、磷的分泌和骨的重建,是调节钙磷代谢的重要肽类激素。

甲状旁腺机能减退症是由于疾病、衰老和手术损伤引起的甲状旁腺激素分泌不足所导致的一种钙磷代谢调节障碍性疾病。疾病、衰老导致的甲状旁腺机能减退症以脱钙、骨骼再生障碍、骨质疏松为特征；手术损伤引起的甲状旁腺机能减退症又分为暂时型和永久型，主要临床特征以低血钙导致的低钙抽搐和心血管系统功能障碍为特征。

由于疾病、衰老导致的甲状旁腺机能减退症，多见于老年化、孕产妇、更年期妇女、长期使用糖皮质激素的自免疾病患者和肿瘤患者。临床上表现为骨质疏松，随着老年化趋势凸显，发病率持续攀升，中国目前的骨质疏松人数达到2.5亿。 手术损伤引起的甲状旁腺(PTG)损伤是急性继发性甲状旁腺机能减退症主要原因。我国每年由于甲状旁腺损伤导致甲旁功能减退达到50万以上，到2019年，中国永久性甲状旁腺损伤累计人数超过500万。

针对甲状旁腺机能减退症，目前除了补钙等对症替代疗法，尚无有效对策。甲状旁腺激素补充和替代疗法成为从源头上阻断疾病发生发展的主要策略。随着基因工程技术发展，美国礼来制药公司首先开发出针对提升甲状旁腺激素水平的基因工程产品-重组人甲状旁腺激素（PTH1-34aa）注射液（特立帕肽注射液），2002年获得美国FDA批准上市，2011 年3月份，被中国国家食品药品监督管理局批准在中国上市，用于治疗甲旁低和钙磷代谢障碍导致的严重骨质疏松。

但现用的重组人甲状旁腺激素制剂存在不足之处，影响力临床使用。首先重组PTH在体内在体内代谢快，很不稳定，需每日定时用药维持血药浓度，因此增加了用药难度和影响疗效；第二是毒副作用，用药后可出现眩晕，肌肉酸痛，呼吸困难，恶心呕吐；更大的限制是本品治疗最长时间不能超过24个月，而且病人终生只可以介绍一次最长24个月的治疗。第三是制备成本高：由于PTH表达产物含量很低，分离纯化困难，导致制备成本高，药物昂贵，限制了规模化使用。

人们不断在重组PTH制备工艺和产品结构上进行改进和优化，设法克服和弥补现用重组PTH制剂的缺陷，所以目前国内外针对甲旁素的基因工程技术专利主要集中在优化重组人甲状旁腺激素产品性能和提升产量等方面。如：范文超于2012年申请了发明专利【人甲状旁腺激素1-34 的制备方法】(CN 102304518 A)，该发明将编码人甲状旁腺激素的基因与硫氧还蛋白标签融合表达，并进一步构建高表达PTH工程菌; 丁邦等发明专利【重组人甲状旁腺激素PTH1-34 的制备方法】（CN 1807456 B）提供了含重组人甲状旁腺激素的Trx-PTH1-34 融合蛋白，赵彬等的发明专利（CN 1256431C）构建了基因重组表达载体和重组人PTH的制备方法。从专利查询平台检索已申报的相关PTH基因工程产品专利，绝大部分是关于重组甲状旁腺激素制备的专利，其余部分是关于甲状旁腺激素制剂等相关专利，但是到目前为止，未能从根本上突破重组PTH制剂的局限性。