[发明专利]一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法

权利要求书

1.一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法，包括以下步骤：

1)使用NCBI BLAST、Sequence Alignment Tool和In-silico Digestion预测地舒单抗的候选特征性肽段，以待测血清对应的物种为目标种属，确定种属的序列同源性，舍弃受该种属内源性蛋白干扰的肽段；所述物种包括人和猴；

2)使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行酶解，使用Waters UPLC I-Class VionMS/MS Qtof对酶解后的样品进行检测，确认候选特征性肽段的带电荷状态和主要碎片离子，选择灵敏度较高的肽段作为定量分析的目标肽段，并根据选择的肽段合成类似肽段作为内标；

当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，人同位素内标为C端用¹³C6标记的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的肽段；当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，猴同位素内标为C端用¹³C6标记的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的肽段；

3)使用能与地舒单抗特异性结合的磁珠对血清样品中的地舒单抗进行免疫捕获，再使用ProteinWorks Auto-eXpress Low kit对免疫捕获的血清样品进行酶解，酶解后样品再经ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit纯化富集；

4)使用空白血清分别配制系列浓度的地舒单抗线性工作液和内标工作液；

5)得到定量分析的目标肽段和内标后，使用型号为Waters UPLC H-Class XEVO TQ-XS的液相色谱质谱联用仪对步骤3)纯化富集后的样品进行液相色谱和质谱定量检测；所述色谱的定量检测条件包括：

色谱柱为Peptide BEH系列色谱柱；

流动相A为乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸在乙酸水溶液中的体积百分含量为0.3％；

流动相B为甲酸乙腈溶液，所述甲酸乙腈溶液中甲酸在甲酸乙腈溶液中的体积百分含量为0.2％；

样品室温度为8℃；

柱温为30～50℃；

进样量为2～7μL；

流速为0.25mL/min；

梯度洗脱条件为：0～1.5min，流动相A 80％，流动相B 20％；1.5～3min，流动相A 80％→74％，流动相B 20％→26％；3～6.5min，流动相A 74％→5％，流动相B 26％→95％；6.5～8min，流动相A 5％，流动相B 95％；8～9min，流动相A 5％→80％，流动相B 95％→20％；

所述质谱的定量检测条件包括：

采用电喷雾电离源(ESI)，正离子模式，多重反应检测，主要参数包括：Capillaryvoltage:1.00～2.00kV；Sample cone:20～30V；Source temperature:150℃；Desolvationtemperature:500～600℃；Desolvation gas flow:900～1000L/h；Cone gas flow:10L/h；

当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的质谱条件包括：MRM离子对：745.36→696.82，锥孔电压：35V，碰撞能量16V；

人同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：768.17→513.26，锥孔电压：40V，碰撞能量26V；

当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的质谱条件包括：MRM离子对：765.17→696.99，锥孔电压：40V，碰撞能量14V；

猴同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：783.64→547.96，锥孔电压：38V，碰撞能量18V；

所述步骤1)和3)没有时间先后顺序的限定，所述步骤3)和4)没有时间先后顺序的限定。