[发明专利]一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法

说明书

本发明涉及一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法，属于抗体检测技术领域。本发明采用液质联用技术，对人血清中地舒单抗的浓度进行定量检测，解决了传统配体结合分析法检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，易受到内源性抗体干扰导致的检测结果不可靠等问题，也解决了已建立的LC‑MS/MS法灵敏度不足的问题。

技术领域

本发明涉及抗体检测技术领域，具体涉及一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法。

背景技术

地舒单抗(Denosumab)是一种全人源化的、针对RANKL的单克隆抗体(IgG2)，能够特异性地阻断RANKL与RANK的结合，从而抑制破骨细胞的生成、分化及活化，减少骨质重吸收，达到治疗效果。地舒单抗注射液于2010年经美国FDA批准用于多发性骨髓瘤、实体瘤骨转移引起的骨相关事件的预防、不可切除的或手术切除会导致严重并发症的成人或骨成熟青少年骨巨细胞瘤的治疗和双磷酸盐耐药的高钙血症的治疗。2019年地舒单抗注射液(Denosumab Injection)获得国家药品监督管理局批准，用于治疗不可手术切除或者手术切除可能导致严重功能障碍的骨巨细胞瘤，包括成人和骨骼发育成熟(定义为至少1处成熟长骨且体重＞45kg)的青少年患者。临床资料显示地舒单抗比其他现有的抗骨吸收药物(如唑来膦酸)更有效地预防骨骼相关事件，但是，地舒单抗治疗的患者偶尔会观察到一些严重的不良反应，如低钙血症、颌骨骨坏死，其最严重的毒副反应是感染。到目前为止，疗效和不良反应与血清地舒单抗浓度的关系仍然不明确。目前，国内已有多家制药企业加入地舒单抗生物类似药开发，在进行临床前或临床I期研究中。

与其他大分子药物类似，一般使用配体结合分析(如ELISA)来检测血清中地舒单抗的浓度，虽然配体结合分析法具有简便、灵敏、高通量的优点，但同时存在检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，很容易受到内源性抗体干扰，导致检测结果不可靠等缺陷。

LC-MS/MS在线性范围、选择性、精密度和准确度等方面较配体结合分析法具有明显优势，且LC-MS/MS的前处理方法和色谱质谱检测方法确定后，通常类似抗体药物均能检测，可克服配体结合分析法的缺陷。目前已有日本科学家建立LC-MS/MS定量检测人血清中地舒单抗的方法，定量下限为2500ng/mL，检测线性为2500ng/mL～80000ng/mL，此灵敏度下仅能满足临床患者血药浓度较高时血清药物浓度检测(每4周给予120mg药物的癌症病人)，而对于地舒单抗治疗骨质疏松症(每6个月注射60mg)的病人血样因灵敏度不足无法检测，而对于新药临床一期和二期研究，通常给药剂量较低，因此急需建立更高灵敏度的LC-MS/MS定量检测人血清中地舒单抗的方法，以满足临床研究和临床血药浓度监测需要。

另外，在地舒单抗的临床前研究中，根据蛋白序列同源性、体外生物活性(亲和力、受体/配体结合率、药效学活性)、组织交叉反应体现猴是临床前研究最相关的种属，需选择食蟹猴或恒河猴进行临床前药效试验、药代动力学试验、毒理学试验研究，因此建立可靠的检测方法进行临床前药代动力学(PK)和毒代动力学(TK)样品试验猴血清中地舒单抗浓度检测为临床前研究所必须。

目前已有沈阳药科大学研究人员建立LC-MS/MS定量检测猴血清中地舒单抗的方法，定量下限为100ng/mL，检测线性为100g/mL～30000ng/mL。而ELISA法的定量为2ng/mL，因此已建立的LC-MS/MS方法与ELISA法灵敏度上有明显不足。另外，地舒单抗临床前的毒代动力学研究发现，因地舒单抗对食蟹猴多次给药后，免疫阳性发生率高达50～70％，免疫阳性可导致食蟹猴体内的药物浓度断崖式降低，这就要求建立的检测方法既能满足线性范围宽，且灵敏度需足够低，显然定量下限为100ng/mL的定量下限还不足于临床前PK和TK的样品检测。

发明内容