[发明专利]用于DNA循环迭代组装的系统及方法

权利要求书

1.DNA组装的方法，其特征在于，提供用于DNA循环迭代组装的系统，所述系统包括供体系统和受体系统；

所述供体系统包括接合转移辅助元件和供体元件；所述接合转移辅助元件包括氨苄青霉素抗性质粒；所述供体元件为环形质粒，包括下一轮待组装DNA片段、本轮组装Cas9切割位点、下一轮组装Cas9切割位点、sgRNA元件和筛选标记，所述供体元件包括第一供体元件、第二供体元件、第三供体元件和第四供体元件；

所述第一供体元件包括下一轮待组装DNA片段DNA2、本轮组装Cas9切割位点T1、下一轮组装Cas9切割位点T2、sgRNA元件sgRNAT1和筛选标记aadA；

所述第二供体元件包括下一轮待组装DNA片段DNA3、本轮组装Cas9切割位点T2、下一轮组装Cas9切割位点T3、sgRNA元件sgRNAT2和筛选标记aac(3)IV；

所述第三供体元件包括下一轮待组装DNA片段DNA4、本轮组装Cas9切割位点T3、下一轮组装Cas9切割位点T4、sgRNA元件sgRNAT3和筛选标记aadA；

所述第四供体元件包括下一轮待组装DNA片段DNA5、本轮组装Cas9切割位点T4、下一轮组装Cas9切割位点T1、sgRNA元件sgRNAT4和筛选标记aac(3)IV；

所述受体系统包括切割重组辅助质粒和受体元件；所述切割重组辅助质粒包括卡那霉素抗性质粒；所述受体元件为线形质粒，包括细菌人工染色体（BAC）骨架、telN基因、Cat筛选标记、本轮待组装DNA片段、本轮组装Cas9切割位点、端粒结构；

所述本轮待组装DNA片段与所述下一轮待组装DNA片段含有100bp~500bp的同源序列；

基于所述系统，通过接合转移作用将所述供体元件从所述供体系统转移到所述受体系统中，包括：

第一轮DNA组装：通过接合转移作用，将第一供体元件转移到受体系统中，在telN的作用下，所述第一供体元件线形化，sgRNAT1表达，引导Cas9切割T1位点，本轮待组装DNA片段DNA1和下一轮待组装DNA片段DNA2借助其同源序列组装成1条DNA，获得第二受体元件；

第二轮DNA组装：通过接合转移作用，将第二供体元件转移到受体系统中，在telN的作用下，所述第二供体元件线形化，sgRNAT2表达，引导Cas9切割T2位点，本轮待组装DNA片段DNA1+DNA2与下一轮待组装DNA片段DNA3借助其同源序列组装成1条DNA，获得第三受体元件；

第三轮DNA组装：通过接合转移作用，将第三供体元件转移到受体系统中，在telN的作用下，所述第三供体元件线形化，sgRNAT3表达，引导Cas9切割T3位点，本轮待组装DNA片段DNA1+DNA2+DNA3与下一轮待组装DNA片段DNA4借助其同源序列组装成1条DNA，获得第三受体元件；

第四轮DNA组装：通过接合转移作用，将第四供体元件转移到受体菌中，在telN的作用下，所述第四供体元件线形化，sgRNAT4表达，引导Cas9切割T4位点，本轮待组装DNA片段DNA1+DNA2+DNA3+DNA4与下一轮待组装DNA片段DNA5借助其同源序列组装成1条DNA，获得第四受体元件；

基于上述步骤完成四轮DNA循环组装，通过供体元件、切割位点T1~T4、筛选标记的循环利用，组装过程可以继续循环进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述系统中，所述卡那霉素抗性质粒包括pCas；

所述供体元件或所述受体元件包括质粒或菌体；

所述受体元件的端粒结构包括telL和telR。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述供体元件还包括复制起始位点和接合转移起始位点；所述复制起始位点包括p15a；所述接合转移起始位点包括oriT。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，T1具有如SEQ ID No.1所示序列；T2具有如SEQ ID No.2所示序列；T3具有如SEQ ID No.3所示序列；T4具有如SEQ ID No.4所示序列。