[发明专利]用于DNA循环迭代组装的系统及方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于DNA循环迭代组装的系统及方法。本发明的循环迭代策略采用四个供体质粒循环利用，采用四个Cas9切割位点和两个筛选标记的设计；本发明中Cas9基因、λRed系统、telN基因是采用质粒形式实现，Cas9基因、λRed系统、telN基因整合到大肠杆菌基因组上可以的达到同样DNA组装的效果。该方法一方面不需要对DNA进行繁琐的体外抽提、酶切、回收等操作，另一方面避免传统大片段DNA组装需要制做原生质体等感受态细胞过程，具有操作简单自动化程度高、成本低等优点。该方法连续组装4轮后，5个DNA片段的组装阳性率可达98.4％，具有DNA组装阳性率高的优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于DNA循环迭代组装的系统及方法。

背景技术

DNA组装技术是将2或多个DNA片段按照即定的顺序连接成1条DNA片段的技术，它是合成生物学的关键技术，目前发展了多种基于胞外和胞内的DNA组装技术，而实现DNA组装技术的自动化、高通量、低成本是未来的发展趋势。

胞外的DNA组装技术有聚合酶链式组装法(PCA)、连接酶链式组装法(LCA)、Biobrick、Golden Gate Assembly、Gibosn Assembly等，以上方法可以将2或多个DNA片段连接成1条长DNA。基于以上组装技术的原理，目前已经发展了自动化组装设备或装置。2017年，合成基因组学公司(Synthetic Genomics，SG)研究团队发布了一款数字生物转换器(digital-to-biological converter)，能够自动化组装5.4kb长的DNA。Tecan等厂商则开发了针对酶法反应、克隆验证的自动化移液和克隆筛选等商品化设备。而这些方法最长只能将DNA片段组装到几十kb，并且随着组装长度的增加，DNA组装的效率越来越低。

胞内的DNA组装方法最常用的是利用酿酒酵母同源重组组装，可以实现100kb以上长度DNA的组装。2008年，Gibson等在酿酒酵母体内成功组装580kb的生殖道支原体基因组，为了寻求更精简支原体的组装方法，研究者直接将生殖道支原体JCVI-1.0的基因组分为25个DNA片段，转化酿酒酵母一步完成支原体基因组的组装。但酿酒酵母组装体系需要繁琐高成本的制备酿酒酵母原生质体和体外操作大片段DNA等过程，使得大片段DNA的组装难以实现自动化、高通量、低成本。

综上所述，避开胞内组装体系制作原生质体和体外操作大片段DNA的过程，降低大片段DNA的组装成本和提高自动化程度，具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于DNA循环迭代组装的系统及方法。针对现有胞外和胞内DNA组装技术需要抽提质粒、DNA酶切、胶回收和需要制作感受态(如原生质体等)等操作过程，存在操作繁琐、自动化程度低、成本高的问题，本发明组装DNA不需要制备原生质体、避开体外繁琐的操作DNA，便于实现大片段DNA自动化、低成本组装。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了用于DNA循环迭代组装的系统，包括供体系统和受体系统；

所述供体系统包括接合转移辅助元件和供体元件；所述接合转移辅助元件包括氨苄青霉素抗性质粒；所述供体元件为环形质粒，包括下一轮待组装DNA片段、本轮组装Cas9切割位点、下一轮组装Cas9切割位点、sgRNA元件和筛选标记；

所述受体系统包括切割重组辅助质粒和受体元件；所述切割重组辅助质粒包括卡那霉素抗性质粒；所述受体元件为线形质粒，包括细菌人工染色体(BAC)骨架、telN基因、Cat筛选标记、本轮待组装DNA片段、本轮组装Cas9切割位点、端粒结构。

在本发明的一些具体实施方案中，所述氨苄青霉素抗性质粒包括RK2-Z2；所述卡那霉素抗性质粒包括pCas；

所述供体元件或所述受体元件包括质粒或菌体；