[发明专利]7α-羟基类固醇脱氢酶突变体St-2-2 △C10及其应用

说明书

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体St‑2‑2△C10及其应用。本发明提供一种7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α‑羟基类固醇脱氢酶的C‑端截短10个氨基酸所得。该突变体具有底物选择性，能够专一性催化CDCA及其牛磺酸或甘氨酸缀合物，对于CA及其牛磺酸或甘氨酸缀合物没有催化活性，可用于从复杂底物鸡胆粉中高效合成TUDCA，而不产生有毒物质即副产物TUCA，在特异性生物转化TCDCA获取TUDCA的过程中具有巨大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α-羟基类固醇脱氢酶(St-2-2)的突变体St-2-2 △C10及其在以复杂底物鸡胆粉为原料催化制备TUDCA中的应用。

背景技术

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性，还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。早有文献指出7α-HSDHs能够催化胆酸(CA)或鹅去氧胆酸(CDCA)及其牛磺酸或甘氨酸缀合物——牛磺胆酸(TCA)，牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)，甘氨胆酸(GCA)和甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)C-7位的α-位羟基脱羟基反应形成酮基。

HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大的应用潜力。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-HSDH、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有8个，它们分别来自于Bacteroidesfragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum、Stenotrophomonas maltophilia、Eubacterium sp.VPI 12708、Clostridium difficile和Escherichia coli；来自C.absonum，Collinsella aerofacien，Ruminococcus gnavus和R.torques的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。

有文献指出，选择鸡胆粉这类复杂基质作为生物合成TUDCA的底物，因为鸡胆粉主要以TCDCA为主，且鸡胆粉来源广泛可以入药，将废弃的鸡胆粉作为培育熊胆粉的底物，变废为宝，提高资源利用度。鸡胆粉中TCDCA的含量为42.58％，但是TCA含量占4.743％，生物催化合成后的产物中出现TUCA，影响产品的纯度，增加了后期产品纯化分离的困难。此外，TUCA游离型UCA是一种天然的胆酸，在体内肠道厌氧菌作用下转化生成次级胆汁酸脱氧胆酸DCA，DCA是一种肿瘤刺激因子，通过激活信号传导通路促进大肠癌上皮细胞的侵袭和生长，可以诱导大肠癌的发生。同时卫生部规定人工熊胆粉中TUDCA的含量不低于23％。因此，有必要挖掘具有底物选择性的7α-HSDHs或者通过分子改造技术使7α-HSDHs具有底物选择性，从而高效合成TUDCA，使其更好的应用于工业化生产中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种专一性催化CDCA及其缀合物的酶，该酶具有底物选择性，可识别特定底物(CDCA、TCDCA、GCDCA)，在以复杂底物鸡胆粉为原料催化制备TUDCA中具有巨大的应用价值。

一方面，本发明提供一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的C-端截短10个氨基酸所得。