[发明专利]RNA文库的构建方法

说明书

本发明提供了一种RNA文库的构建方法。该构建方法包括：采用逆转录引物对片段化的RNA进行逆转录，得到第一链cDNA，逆转录引物从5’端至3’端依次包括：已知序列和随机序列；采用环化酶将第一链cDNA进行单链接头连接得到连接产物；对连接产物进行PCR扩增得到RNA文库。通过在对RNA逆转录合成第一链cDNA的同时即引入了第一测序引物序列，随后直接通过环化酶进行单链接头连接引入第二测序引物序列，最后根据第一测序引物序列和第二测序引物序列设计合适的扩增引物对接头连接产物进行PCR扩增，即可得到RNA文库。该方法既无需第二链cDNA的合成，也无需其他消化过程直接实现链特异性，操作简单，节省工时。

技术领域

本发明涉及RNA测序文库构建领域，具体而言，涉及一种RNA文库的构建方法。

背景技术

转录组测序技术，RNA-seq是研究生物基因表达的重要工具，该技术广泛应用于不同物种的基因表达图谱分析中。近年来出现的RNA-seq建库试剂盒主要侧重于RNA链特异性研究，文库建库过程需要提取总RNA并富集mRNA，通过逆转录合成第一链cDNA，使用dUTP合成第二链cDNA，随后进行双链cDNA的末端补平、加腺嘌呤A碱基再进行接头连接，消化含尿嘧啶U碱基的cDNA后通过PCR扩增完成建库。

现有技术的建库过程比较繁琐：

(1)需要添加dUTP合成双链cDNA，通过尿嘧啶U碱基区分链特异性；

(2)对cDNA进行末端补平修复及对cDNA的3’端加腺嘌呤A碱基，保证cDNA双链的3’端含有A碱基悬挂进而配合接头的3’端胸腺嘧啶T碱基实现TA连接完成建库；

(3)需要设计两条单链接头并退火形成双链，且含有硫代硫酸酯键修饰，保证接头T碱基不会脱落，才能进行有效接头连接；

(4)最后，在进行PCR之前还需对含有尿嘧啶U碱基的cDNA第二链进行消化才能实现链特异性建库。

因此，需要对现有的RNA文库构建方法进行改进，以提供一种简单快速的建库方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种RNA(起始量100ng-1000ng)文库的构建方法，以解决现有技术中的建库过程繁琐的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种RNA文库的构建方法，该构建方法包括：采用逆转录引物对片段化的RNA进行逆转录，得到第一链cDNA，其中，逆转录引物从5’端至3’端依次包括：已知序列和随机序列；采用环化酶将第一链cDNA进行单链接头连接，得到连接产物；对连接产物进行PCR扩增，得到RNA文库。

进一步地，逆转录引物在已知序列的上游，还包括有间隔臂。

进一步地，随机序列为4～8碱基的随机序列，更优选为6碱基的随机序列。

进一步地，间隔臂为Spacer C12、Spacer C6、Spacer C3、NH₂和ddC中的任意一种。

进一步地，逆转录引物的序列为SEQ ID NO:1。

进一步地，环化酶为环化酶II或T4 RNA连接酶1。

进一步地，单链接头的5’端带有腺苷化修饰，3’端带有ddC修饰；优选地，单链接头的序列为SEQ ID NO:2。

进一步地，采用上游扩增引物和下游扩增引物对连接产物进行PCR扩增，得到RNA文库，上游扩增引物从5’端至3’端依次包括：上游测序平台序列、第一文库标签序列以及上游测序引物序列，下游扩增引物从5’端至3’端依次包括：下游测序平台序列、第二文库标签序列以及下游测序引物序列，其中，下游测序引物序列与逆转录引物的5’端的至少部分序列相同，上游测序引物序列与单链接头的5’端的至少部分序列相同；优选地，第一文库标签序列和第二文库标签序列的长度分别为4～10bp。