[发明专利]适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因及其应用

说明书

本发明公开了适用于天目地黄的qRT‑PCR内参基因及其应用。本发明基于天目地黄花的5个不同发育时期和叶转录组数据中筛选出6个表达量相对稳定的候选内参基因，并利用qRT‑PCR技术，通过GeNorm、NormFinder和Bestkeeper 3种不同算法对候选参考基因的稳定性进行分析。结果表明，针对天目地黄花和叶组织的最佳内参基因数目为两个，为RcTIP41和Rc18S；其中，RcTIP41基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Rc18S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明确定了天目地黄花和叶qRT‑PCR的最适内参基因，并提供了内参基因的特异性引物，为天目地黄中相关基因表达的精确定量分析提供了重要参考。

技术领域

本发明涉及适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

天目地黄(Rehmannia chingii Li.)属于玄参科地黄属多年生草本植物，主要分布在浙江、安徽等地，其花冠大而艳，呈紫红色，与地黄属其它物种有着明显的区别，是常见大宗中药材地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的野生近缘种。天目地黄花和叶含有丰富的环烯醚萜苷、苯乙醇苷、花青素、多糖等多种化学成分，具有保肝、抗炎、神经保护、抗氧化、降血糖等多种药理活性，不仅在中药开发和利用方面具有重要的价值，而且也可用于食品、饲料及天然产物提取。对天目地黄花和叶的发育和次生代谢产物合成积累及其调控机制的研究，需要进一步挖掘参与器官发育和次生代谢产物积累的功能基因，并研究基因的时空表达模式和分子功能。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是对目标基因表达定量应用最广泛的分子生物学方法，具有精确度高、灵敏性强、特异性强和重复性好等特点，也常用于植物学、医学、微生物学等众多领域的研究。但是，qRT-PCR对目标基因表达量准确分析的前提是筛选出稳定表达的内参基因。理想的内参基因应该不受生长阶段、组织器官及实验处理条件的影响。然而，内参基因在不同植物以及不同实验条件下并不是恒定的，而且内参基因在不同植物中并不具有通用性。此外，关于天目地黄内参基因的研究还较为匮乏，虽然天目地黄的近缘物种地黄的内参基因筛选和利用已有报道，然而天目地黄和地黄的基因序列存在较大差异，且表达特性也有所不同，因此，地黄的内参基因并不能作为天目地黄qRT-PCR的内参基因。

目前，适宜用于天目地黄qRT-PCR研究的内参基因还未见报道。因此，对天目地黄功能基因表达特性的进一步研究，必须针对天目地黄筛选出表达稳定可靠的内参基因。

发明内容

本发明的目的是提供适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因，所述内参基因为RcTIP41基因和/或Rc18S基因，该内参基因基于天目地黄花的5个不同发育时期和叶转录组数据筛选得到，为进一步准确定量天目地黄功能基因转录表达水平及相关基因工程工作的开展奠定基础。

本发明的另一目的是提供RcTIP41基因和/或Rc18S基因作为内参基因在qRT-PCR检测天目地黄基因转录表达水平中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了适用于天目地黄的qRT-PCR内参基因，所述内参基因为RcTIP41基因和/或Rc18S基因，所述RcTIP41基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述Rc18S基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了RcTIP41基因和/或Rc18S基因作为内参基因在qRT-PCR检测天目地黄基因转录表达水平中的应用。

RcTIP41基因的特异性引物为：

RcTIP41-F：5’-AAGAGCAGCTTCAGACTTCC-3’(SEQ ID NO.3)

RcTIP41-R：5’-GAATTTCCATTGAGCAGCCG-3’(SEQ ID NO.4)