[发明专利]利用YPB肽段抑制乳腺癌细胞增殖及肿瘤生长的方法和应用

权利要求书

1.一种YPB肽段，其序列为P-P-R-K-K-K-R-K-H-R-L-W-A-A-H-C-R-K-I-Q-L-K-K-D-G-S-S。

2.如权利要求1所述的YPB肽段在制备用于抑制乳腺癌细胞增殖或乳腺癌肿瘤生长的药物中的应用，其特征在于通过YPB肽段与TAT和GGG合成，再标记上带有荧光的FITC，得到FITC-TAT-GGG-YPB多肽；所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽用于阻遏YY1和EZH2的结合。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽的序列为FITC-YGRKKRRQRRR-GGG-PPRKKKRKHRLWAAHCRKIQLKKDGSS。

4.如权利要求2中所述的YPB肽段的筛选及所述的FITC-TAT-GGG-YPB多肽的合成的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、利用大肠杆菌表达His×6-YY1蛋白并进行纯化；将EZH2功能区域分为4个片段，分别为Mut1：第1-251位氨基酸、Mut2：第252-384位氨基酸、Mut3：第385-604位氨基酸和Mut4：第604-746位氨基酸；构建GST-融合蛋白，并利用大肠杆菌进行蛋白表达和纯化，得到纯化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白；

二、通过胺类偶合法将纯化后的His×6-YY1蛋白偶联到偶联用芯片上，然后利用生物大分子互作仪分别测定纯化后的GST-EZH2-Mut1、Mut2、Mut3和Mut4蛋白与His×6-YY1蛋白的结合程度，经过筛选，得到EZH2上一段负责与YY1的结合序列，将这一段序列命名为YPB肽段，其序列为P-P-R-K-K-K-R-K-H-R-L-W-A-A-H-C-R-K-I-Q-L-K-K-D-G-S-S；最后将YPB肽段与TAT和GGG合成，再标记上带有荧光的FITC，得到FITC-TAT-GGG-YPB多肽；所述FITC-TAT-GGG-YPB多肽的序列为FITC-YGRKKRRQRRR-GGG-PPRKKKRKHRLWAAHCRKIQLKKDGSS。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤一中所述利用大肠杆菌表达His×6-YY1蛋白并进行纯化的步骤如下：

(1)将YY1连接到pHis×6的原核表达载体上，构建得到pHis×6-YY1表达载体；将pHis×6-YY1表达载体转入到大肠杆菌BL21 Tuners菌株内，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃的摇床中以220rpm的转速过夜培养；将过夜培养后的菌液按1：50的比例加入到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃下培养2h～3h；

(2)将步骤(1)培养后的菌液降至16℃，加入浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在16℃下继续培养6h～8h或过夜；将菌液在4,000×g、4℃下离心20min，收集细菌，然后用25mL的缓冲液I重悬，缓冲液I由20mM Tris·HCl、200mM NaCl、1mM DTT和pH7.5、1×蛋白酶抑制剂组成；将装有菌液的离心管在冰水的环境下进行超声波处理，每处理30s间歇1min，直至菌体完全裂解；用20,000×g在4℃下离心30min，保留上清液，将上清液与1mL带有镍的树脂混合，在4℃下滚动结合2h，然后将树脂装入层析柱，先用20mM的咪唑洗涤层析柱两次、每次10mL，然后用40mM的咪唑洗涤层析柱两次、每次10mL，再用200mM的咪唑洗脱层析柱10次、每次200μL，得到含有His×6-YY1的洗脱样品；

(3)将含有His×6-YY1的洗脱样品合并，在4℃条件下进行透析，每隔5小时更换一次透析液，共更换三次透析液，透析液由1.5M NaCl、0.05M Tris-HCl和1mM DTT组成，pH为7.5；将透析后的样品分装后冻存于-80℃下。