[发明专利]一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法

权利要求书

1.一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、鸡ACE2基因PCR扩增及回收：采用鸡空肠cDNA为模板，根据NCBI鸡ACE2序列MK560199，按照引物设计原则设计PCR引物，并在上游引物起始密码子ATG前加入pcDNA3.1(+)载体同源臂和EcoRI酶切位点，引物序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2、载体和目的片段的重组采用同源重组方式连接；

步骤3、菌落PCR、酶切和测序验证pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒的构建结果；

步骤4、以脂质体方法转染至CHO细胞，经G418初步筛选后再经单克隆进一步筛选，使重组质粒能在CHO细胞中稳定表达；

步骤5、RT-PCR、Western-blot、免疫荧光鉴定pcDNA3.1(+)-ACE2重组体表达结果；

步骤6、双抗体夹心法测定ACE2活性蛋白的酶活性。

2.根据权利要求1所述的鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，其特征在于，步骤1中，PCR扩增的反应条件：95℃预变性1min，95℃变性20s，59℃退火20s，72℃延伸1min15s，72℃彻底延伸5min，32个循环。

3.根据权利要求1所述的鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，其特征在于，步骤2中，反应连接体系(20uL)：包括4uL pcDNA3.1(+)载体，1uL目的序列，1uL同源重组酶，4uL5×Buffer，三蒸水10uL于200uLEP管中，混匀后，50℃，连接10min。

4.根据权利要求1所述的鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法，其特征在于，步骤4中，加G418筛选14d后确定G418最低致死浓度为800ug/mL。

5.根据权利要求1所述的鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法，其特征在于，步骤4中，将CHO细胞分为空白组、转染空质粒pcDNA3.1组以及转染pcDNA3.1-ACE2组，吸取转染混合液加入6孔板里，空白组不作任何处理，37℃，5％CO2培养6h后弃转染混合液，PBS洗涤。再分别加入2mL DMEM/F12(含10％FBS)液，继续培养。

6.根据权利要求1所述的鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法，其特征在于，步骤5中，Western blot鉴定时，细胞蛋白提取步骤将筛选单克隆细胞的6孔板，PBS洗涤两次，加入蛋白裂解液，裂解15min，用细胞刮板将细胞刮进EP管。4℃，12000g/min离心20min，上清液即为所提取的蛋白溶液。BCA法测蛋白浓度，并统一蛋白浓度至4mg/mL。

7.根据权利要求1所述的鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法，其特征在于，步骤6中将分别转染了空质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-ACE2 CHO细胞以及空白对照细胞提取细胞蛋白，双抗体夹心法测定ACE2活性蛋白酶活性。