[发明专利]一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法

说明书

本发明公开了一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建、鉴定与表达方法，包括构建ACE2真核表达载体，转染CHO细胞，筛选稳定表达的pcDNA.3.1(+)‑ACE2细胞株，获得具有生物学活性的ACE2蛋白并测定酶活。本发明具有：①快速：仅需要1小时②简单：无需酶切③高效：阳性率达95％以上④无缝：不引入额外序列等优点。ACE2具有抗炎、抗损伤、抗纤维化等机体保护功能，特别作为SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2主要功能性受体，具有保护肺损伤功能。目前缺乏生物活性的鸡ACE2蛋白，限制了其生物学功能的研究。本发明为深入研究鸡ACE2作为病毒受体在禽冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。所以本发明无论是从基础研究还是临床运用的意义都是十分重大的。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鸡ACE2(Angiotensin converting enzyme2)真核表达重组质粒载体的构建、鉴定并获得稳定过表达ACE2基因的细胞株方法。

背景技术

血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000 年首次报道的一种单羧肽酶，作为肾素-血管紧张素系统系统的重要一员，在调节心血管、肾脏功能及肠道功能中发挥重要作用。2003年，研究发现 ACE2是急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)的主要功能性受体，具有介导SARS-CoV入侵和细胞融合等作用，研究证实ACE2基因的表达水平与SARS-CoV的进入及疾病的严重程度密切相关。2019年研究发现SARS-CoV-2可以使用除小鼠ACE2外的所有ACE2作为受体进入细胞内，与SARS-CoV一样，以细胞受体ACE2来入侵感染细胞。

根据病毒溯源研究证明，SARS-CoV、SARS-CoV-2等冠状病毒均以动物作为自然宿主或中间宿主，因此，对动物ACE2受体功能的研究有助于阐明该病毒的跨种感染机制。但目前，ACE2的研究主要集中在人、小鼠、大鼠、斑马鱼等多种哺乳动物及水生动物，包括家禽在内的其他动物的 ACE2生物学功能目前尚不清楚。

在本发明研究中，拟以白羽肉鸡为研究对象，应用RT-PCR和基因克隆技术从白羽肉鸡空肠组织扩增ACE2基因，以同源重组方式连接到真核表达载体pcDNA.3.1(+)，在CHO细胞中通过G418和单克隆筛选获得稳定表达pcDNA.3.1(+)-ACE2的细胞株，以获得具有生物学活性的ACE2蛋白，为深入研究鸡ACE2作为病毒受体在禽冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体 pcDNA3.1(+)-ACE2构建、鉴定与表达方法，目的在于：①用它作为运载工具，将目的基因ACE2转移到宿主细胞中去；②利用它在宿主细胞内对目的基因ACE2进行大量的复制(称为克隆)，为深入研究鸡ACE2作为病毒受体在禽冠状病毒感染中发挥的生物学功能及其分子机制，开发以ACE2为冠状病毒靶向治疗药物奠定基础。其具体技术方案为：

一种鸡ACE2真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：

S1、21日龄白羽肉鸡，颈部放血处死后取心脏、肝脏、肺脏、肾脏、回肠、盲肠、空肠等，经生理盐水漂洗后迅速放入液氮速冻。提取基因组 RNA，反转录为cDNA。设计ACE2的上下游引物用于ACE2全长基因扩增，并在ACE2基因片段两侧分别加入pcDNA3.1(+)载体同源臂及EcoRI 酶切位点，以cDNA为模板，扩增获得ACE2基因全长。EcoRI酶切 pcDNA3.1(+)载体和ACE2 PCR产物，切胶回收目的片段，以同源重组方式将pcDNA3.1(+)载体和ACE2进行连接。经菌液PCR、酶切、测序验证获得质粒pcDNA3.1(+)-ACE2。