[发明专利]一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法在审
申请号: | 202011137169.3 | 申请日: | 2020-10-22 |
公开(公告)号: | CN112280828A | 公开(公告)日: | 2021-01-29 |
发明(设计)人: | 王慧;何牮;孟梅;刘宁宁 | 申请(专利权)人: | 上海交通大学医学院 |
主分类号: | C12Q1/6806 | 分类号: | C12Q1/6806;C12Q1/6869 |
代理公司: | 上海旭诚知识产权代理有限公司 31220 | 代理人: | 郑立 |
地址: | 200025 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 降低 单细胞 扩增 偏倚 组织 细胞核 分离 方法 | ||
本发明公开了一种降低扩增偏倚性的单细胞测序的细胞核分离方法及其应用,该方法包括:将待提取样品在在二号缓冲液中进行裂解处理;将裂解产物进行第一次离心处理,获得细胞核沉淀;将所述细胞核沉淀进行冲洗并在一号缓冲液中重悬,并进行第二次离心处理,最终在三号缓冲液中重悬混匀,以获得最终所需的细胞核。该方法只需常规、简单的试剂耗材,不需要昂贵的分离设备及长时间的梯度离心等操作,便可从较少的组织样本或者细胞中获得足量、完整的单个细胞核用于单细胞全基因实验研究,该方法相较于市售试剂盒处理过的细胞核,用于后续的全基因组扩增产物具更好的扩增均一性,与完整的单个细胞具备相近的扩增效果,同时省时且节约成本。
技术领域
本发明涉及基因测序领域,本发明涉及适用于一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法。
背景技术
单细胞测序是指在单个细胞水平上,对基因组、转录组、表观组等多组学进行高通量测序分析的新技术。改技术的应用使得解释单个细胞的基因结构和基因表达状态,解读细胞间的异质性成为了可能。单细胞测序以备广泛可应用于发育生物学、免疫、肿瘤等方向的研究,并且涌现出大量高质量的研究和科研成果。其中单细胞全基因组测序通过对肿瘤组织中解离后得到的单个细胞的DNA进行全基因组扩增,再进行文库构建及测序,分析每个细胞中的基因情况,研究肿瘤发生发展机制、分子分型等,为肿瘤分型、肿瘤治疗策略、新药研发等提供新的方向。
单细胞测序对样本活性要求较高。人肿瘤组织多坏死病灶,不易获得高活率单细胞悬液,而且单细胞悬液运输过程中无法保证细胞活率。目前的实现方法是携带单细胞分离设备至医院,手术切下的新鲜离体组织立即进行消化及后续的分离处理,使该实验在成本、时间、地点等方面受到较大限制。因此有必要开发一种新的样本处理方法,更便捷地获得合适的样本进行单细胞全基因组测序。
将新鲜的离体肿瘤组织用液氮冷冻为冰冻组织后可用干冰运输及保存,但解冻后难以消化获得高活率的单细胞悬液。在新鲜组织快速冷冻及冷冻保存的过程中会对细胞造成较大的损伤,细胞内RNA游离损失,导致无法进行单细胞RNA测序,而核膜在冻融的过程中可以保持完整。有研究证明细胞核中包含足够量的基因组DNA,可用于测序,且与用完整细胞进行基因组测序具有较高的相关性。由于核膜比细胞膜更易保持完整,与获得单细胞悬液相比,从冰冻组织中获得细胞核悬液的可操作性更强。目前从冰冻组织中获得单核悬液还没有成熟稳定的方法,目前仅有通过昂贵的辅助设备针对冰冻脑组织的单核悬液分离方法,且没有质控结果的展示说明。
同时医院样本库有大量的特色病例、珍稀冷冻标本,这些冰冻样本的利用可以为研究稀有病种、缩短研究周期有很大的帮助。
因而,开发一种简单、方便的分离人离体冰冻肿瘤组织细胞核,获得高活率的单细胞核悬液的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题:如何利用简单、方便的方法分离离体冰冻肿瘤组织细胞核。为此,发明人开发了一种简便的方法,可以从离体冰冻肿瘤组织样本中获得适用于单细胞测序的单核悬液,解除新鲜离体肿瘤组织单细胞测序对时间地点的限制,使单细胞测序技术可以更广泛地应用于离体肿瘤组织微环境的研究。
本发明第一方面是一种提取细胞核的方法,该方法的步骤包括:
1)在二号缓冲液(LB)中进行样品机械裂解处理,经过冰置处理和吹打处理后获得裂解产物;
2)将裂解产物进行第一过滤处理及第一离心处理,获得第一离心细胞核沉淀;
3)将第一离心细胞核沉淀在第一缓冲液(WB)中进行冲洗及第一重悬处理和第二过滤处理,然后进行第二次离心处理,获得第二离心细胞核沉淀;
4)将第二离心细胞核沉淀在三号(NB)缓冲液中进行第二重悬混匀处理后进行第三过滤处理,获得的细胞核悬液;
进一步地,样品为离体样本。
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