[发明专利]一种病原微生物检测用测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：

S1，从样本中提取得到DNA和RNA，共投入到一链合成反应液和一链合成酶中，对RNA进行逆转录，使RNA形成RNA/cDNA复合双链，在RNA逆转录的条件为温度不超过65℃，其时间不超过15min；

S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；

S3，纯化上述步骤中的双链cDNA和双链DNA的混合物；

S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾；

S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；

S6，接着纯化接头连接产物；

S7，文库扩增：步骤S6所得产物中加入扩增酶混合液和引物，进行PCR扩增；

S8，纯化S7中的扩增产物即可以得到原始DNA/RNA可测序的文库。

2.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中的所述样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血清、血浆、血液、尿液或粪便。

3.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中的所述一链合成反应液包括：Tris-HCl 20-70mM、KCl 50-100mM、MgCl₂ 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、RNase Inhibitor 1-10U、Random Primer 0.5-5μM。

4.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中的所述一链合成酶为具有逆转录活性的酶。

5.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中的所述二链合成反应液包括：Tris-HCl 30-100mM、KCl 50-100mM、MgCl₂ 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、dATP 20-100μM。

6.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中的所述二链合成酶包括：Klenow片段0.01-0.05 U/μL、RNase H 0.01-0.1U/μL。

7.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S3中所述双链cDNA和双链DNA的混合物为0.1-100ng。

8.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S4中所述DNA打断修复反应液包括：Tris-HCl 10-50mM、MgCl₂ 10-50mM、DTT 1-10mM、dNTP 20-100μM、dATP 0.2-1mM、NaCl 20-80mM、BSA 0.1-1 mg/ml、TritonX-1000.1%-0.5%。