[发明专利]一种病原微生物检测用测序文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，包括S1，从样本中提取得到DNA和RNA，对RNA进行逆转录；S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；S3，纯化；S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾；S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；S6，纯化；S7，文库扩增；S8，纯化S7中的扩增产物得到原始DNA/RNA可测序的文库。本发明耗时短；对RNA一链合成和二链合成时，只对RNA起作用，不干扰体系中存在的DNA，待RNA转成双链cDNA后与双链DNA一起片段化，真正做到了一个流程实现共建库的效果。

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种病原微生物检测用测序文库的构建方法。

背景技术

感染性疾病多为细菌、病毒和真菌等病原微生物及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原微生物呈现多样化和复杂化的发展趋势。重症急性呼吸综合征(SARS)、新型冠状病毒肺炎(NCP)、新变异型克雅病、H7N9 禽流感等新发感染性疾病不断出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原微生物又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。

快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR（QPCR）、数字PCR、基因芯片技术、测序技术（Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量测序技术）等。

在感染性疾病领域中，获得病原微生物的活体（对于细菌、真菌、病毒而言，主要是培养阳性），是感染性疾病诊断的金标准，但病原微生物的体外培养耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大多数病原微生物不可培养；免疫学方法（如补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等）操作简单，但由于病原微生物种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；PCR检测具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；基因芯片技术只能对已知的病原微生物基因组进行意向性筛查，而无法检测新的未知病原微生物。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原微生物信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。因此，快速、特异且高通量的病原微生物检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。

近年来快速发展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物领域展现了广阔的前景。

对于病原微生物的检测，目前NGS的建库流程为：1.DNA打断（物理法或者酶法）；2.RNA打断；3.RNA逆转录一链合成；4.cDNA二链合成；5.二链cDNA纯化；6.打断的DNA与二链cDNA混合；7.DNA与cDNA末端修复；8.3’末端加尾；9.纯化；10.接头连接；11.纯化；12.PCR文库扩增；13.文库纯化。整个流程（如图1）需要8个小时左右的时间。病原微生物造成的感染往往发病很快，且病原微生物在体内生长繁殖很快，因此需要更快的检测方法，而该方法流程较长，步骤较多，操作时间过长，无法满足医护人员和患者对报告时效性的要求。现有流程对样本起始量也高，一般要求大于100ng。由于感染样本往往来源于胸腹水、肺泡灌洗液、脑脊液和血液等复杂样本，提取得到的核酸质量不高，微生物含量低，往往达不到建库要求。而且，DNA和RNA分开两个流程操作，流程多，纯化也多，造成样本大量损失。