[发明专利]一种用于构建噬菌体抗体库的噬菌粒载体构建方法及抗体筛选方法

说明书

本发明提供了一种用于构建噬菌体抗体库的噬菌粒载体构建方法及抗体筛选方法，所述噬菌粒为外壳蛋白PIII编码基因与目的基因插入位点之间含有牛凝血酶酶切位点的丝状噬菌粒。在噬菌粒中引入牛凝血酶（thrombin）酶切位点，通过蛋白水解裂解，从而导致非特异性洗脱噬菌粒的背景下降。使用本发明提供的噬菌粒筛选抗体效率更高，解决了现有技术中噬菌体展示技术中筛选效率低的问题。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种用于构建噬菌体抗体库的噬菌粒载体构建方法及抗体筛选方法。

背景技术

2018年，噬菌体展示技术(phage display technology)的发明人因为该技术在抗体药物研发领域中的贡献被授予了诺贝尔化学奖。应用基因工程手段把外源DNA片段克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应表达产物与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，然后利用靶分子，采用适当的筛选方法除去非特异性结合噬菌体，最终筛选出能特异性结合靶分子的目的噬菌体。噬菌体抗体库是将噬菌体展示技术、PCR扩增技术、蛋白表达技术相结合的一项运用综合技术手段所建立起来的抗体库。其筛选容量大，抗体库技术可以对百万甚至亿万个分子选择，筛选到的抗体种类更多。

噬菌体载体的使用可能会导致scFv-G3P融合蛋白的多价展示，噬菌粒载体比噬菌体载体更常用于文库构建中，因为可以实现更高的转化效率，从而有助于构建更大的文库。基于此，本发明中用于构建噬菌体抗体库的模型噬菌粒包含三个关键要素(i)用于选择和繁殖质粒的抗生素标记(ii)编码scFv-G3P融合蛋白的基因(iii)滚环扩增和产生能够包装成噬菌体的(+)DNA链所需的M13染色体区域(噬菌体复制起点)。

通过噬菌体技术，可高效获得scFv人源化片段。但是，筛选所用的相应抗原是细胞表面上抗原混合物或分子等的一部分，包含不同的表位，噬菌体展示筛选通常仅产生针对抗原线性表位的抗体片段，为了富集和分离特异性抗体，通常需要多轮选择。最高亲和力结合的抗体片段或噬菌体在筛选过程中具有生长优势，因此，抗弱表位的抗体表位很少被选择，会导致筛选轮次中潜在结合物的多样性丧失，阻碍对亲和力较低的抗体的选择。其次感染后，来自辅助噬菌体的野生型G3P蛋白与编码scFv-G3P融合蛋白的噬菌粒竞争并入噬菌体，90％的噬菌体群体不显示任何融合蛋白，并且带有融合蛋白的绝大多数噬菌体颗粒仅包含一个拷贝，这大大增加了筛选过程中非特异性结合的噬菌体数量，使得筛选轮次增加，筛选效率降低，难度加大。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于构建噬菌体抗体库的噬菌粒载体构建方法及抗体筛选方法，用于解决现有技术中噬菌体展示技术中筛选效率低的问题。

本发明提出了一种应用于噬菌体抗体库筛选的质粒构建新方法，目的是使噬菌体展示筛选效率提高，同时采用该质粒建立了一种模型筛选方法。具体原理为：在噬菌粒scFv-PIII间引入牛凝血酶(thrombin)酶切位点，通过蛋白水解裂解，从而导致非特异性洗脱噬菌粒的背景下降。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于噬菌体展示技术用于筛选抗体的噬菌粒，所述噬菌粒为外壳蛋白PIII编码基因与目的基因插入位点之间含有牛凝血酶酶切位点的丝状噬菌粒。

一种实施方式中，所述噬菌粒由pComb3H改造获得。所述改造方法为在pComb3H的外壳蛋白PIII编码基因与目的基因插入位点之间含有牛凝血酶酶切位点。

具体地，所述pComb3H的Genebank登录号为AF268280。

进一步地，所述牛凝血酶酶切位点为LVPRGS的对应的编码基因(SEQ ID NO.4)。