[发明专利]杨树2n花粉的诱导和分离纯化方法

权利要求书

1.一种杨树2n花粉的诱导和分离纯化方法，其特征在于，包括：(1)用秋水仙碱诱导杨树花粉染色体加倍得到包括2n花粉在内的混合花粉；(2)将混合花粉用过滤器过滤进行初步筛选；(3)将虹吸孔管与显微操纵器相连接；该虹吸孔管的最尖端孔径大小与2n花粉粒的直径大小相当；(4)将初步筛选后的花粉液滴于载玻片上，借助倒置显微镜分辨2n花粉和单倍性花粉，利用显微操纵器将2n花粉吸入到虹吸孔管中，将2n花粉与单倍性花粉完全分离。

2.按照权利要求1所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，所述用秋水仙碱诱导杨树2n花粉的方法包括：当大部分花粉母细胞发育至粗线期时，利用0.5％的秋水仙碱溶液对雄花芽进行注射处理，待花药成熟开裂后收集花粉。

3.按照权利要求2所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，所述的注射处理的次数为7-11次，优选为11次数注射。

4.按照权利要求1所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)将混合花粉用过滤器过滤进行初步筛选的方法包括：将混合花粉置于磷酸盐缓冲液中混匀后过滤，利用磷酸盐缓冲液将滞留在过滤器内的花粉粒洗脱至离心管中；其中，所述的过滤是用孔径为35-45μm的过滤器进行过滤；优选的，所述的过滤是用孔径为40μm的过滤器进行过滤。

5.按照权利要求4所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的组成为：NaCl 135.2mmol/L，KCl 24.2mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.5mmol/L，KH₂PO₄ 1.5mmol/L，pH＝7.3-7.4。

6.按照权利要求1所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述虹吸孔管的制备方法包括：根据诱导得到的2n花粉粒的直径大小，将带棉塞的玻璃巴氏管的一端烘烤并拉成与2n花粉粒的直径大小相当的虹吸孔管。

7.按照权利要求1所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中将虹吸孔管与显微操纵器相连接的方法包括：将虹吸孔管的不是用于直接虹吸的端口与橡胶软管相套接并固定于显微操纵器上。

8.按照权利要求7所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，所述的橡胶软管的长度为30-100cm，优选为60cm。

9.按照权利要求1所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中用移液器从离心管中吸取100-200μL过滤后的含有2n花粉的混合液滴于载玻片上。

10.按照权利要求1所述的诱导和分离纯化方法，其特征在于，所述的杨树是银灰杨(Populus canescens)、毛新杨(Populus tomentosa×Populus bolleana)、银腺杨(Populus tomentosa×Populus bolleana)、响叶杨(Populus adenopoda)、银白杨(Populus alba)或毛白杨(Populus tomentosa)。