[发明专利]一种基于微滴式数字PCR技术的三七粉精准定量方法

说明书

本发明公开了一种利用微滴式数字PCR技术对三七粉成分进行定量检测的方法，以及在该方法中应用到的以三七单拷贝核基因甘油二酯激酶基因（diacylglycerol kinase 1 gene，DGK1）所设计的引物和探针组合。该方法通过建立三七粉质量与DNA浓度、DNA浓度与基因拷贝数的线性关系，最终构建三七粉质量与核基因拷贝数的线性关系，从而计算出三七粉含量。使用本发明的微滴数字PCR方法，能够实现特异、快速、准确的三七粉定量检测，为维护消费者利益及三七粉市场监管提供技术支撑。

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种利用微滴式数字PCR技术对三七粉进行定量的检测方法，包括在该方法中应用到的以单拷贝核基因甘油二酯激酶基因（diacylglycerol kinase 1 gene，DGK1）为靶序列所设计的引物和探针组合，建立三七粉质量与DNA浓度，DNA浓度与基因拷贝数的关系，以DNA浓度为中间量构建三七粉质量与核基因拷贝数的关系，从而测定三七粉含量。

背景技术

三七 [Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen] 是名贵的中药材，同时被列为可用于保健食品的原料。三七中含三七皂苷、黄酮苷、氨基酸与挥发油等有效成分，具有补血、止血、降血脂、改善心肌功能等多种功效。近年来随着人们对三七研究的深入，三七相关的保健食品也呈现出了多元化、高质化、高值化，市场需求量逐年攀增。但由于三七对生态环境要求较高，产区难以扩大和转移，同时三七生长存在连作障碍问题，导致三七产量增长空间受限，价格居高不下。受经济利益驱动，市场中三七掺杂使假问题屡见不鲜，影响了正常的市场秩序。

三七粉是三七的主要制品之一，市场中存在将大米粉、土豆粉、大豆粉等常见的价格较低的可食用粉掺杂到三七粉中的问题。失去原有形态特征的三七粉，给掺杂、掺假带来了较大的便利。目前对三七粉的掺伪鉴别主要采用传统显微性状鉴定和理化分析方法，这些方法存在操作相对复杂、检测结果受三七的生长环境、采收时间、贮藏条件的影响以及无法准确定量等局限性。寻求三七粉的准确定性和精准定量方法是解决三七粉掺假问题的关键，可促进三七保健食品产业链的良性发展。

微滴式数字PCR是近年来迅速发展起来的核酸定量技术，基于油包水原理将含有核酸分子的反应体系生成数万或数百万个微滴，实现理论上的单分子扩增。微滴式数字PCR可消除外源DNA背景对靶基因检测的影响，可实现对低丰度的基因组样品精准检测。微滴式数字PCR技术具有较强的绝对定量能力，不依赖于标准品和标准曲线即可得到目标基因拷贝数，并且有很高的灵敏度、稳定性和重复性。三七粉特异、快速、准确的定量检测问题亟待解决，目前，还未见关于利用微滴式数字PCR定量检测三七粉的相关研究报道。

发明内容

本发明目的在于提供用于三七粉定量检测方法。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的发明人根据三七单拷贝核基因DGK1设计了能特异性鉴别三七源性成分的寡核苷酸引物和探针组合，能从样品DNA中高效特异扩增出一段96 bp的三七特异性基因片段。所述引物包含上游引物和下游引物，上游引物为Panax notoginseng-F：AGACCTATCATGATGATTACTCTTCC，下游引物为Panax notoginseng-R：GAATAGGAGTATGGAAACAGGTAAGAC；所述探针为Panax notoginseng-P：TACCAATCCCAGCGTA，在探针的5’ 端连接有一个荧光报告基团FAM，3’ 端连接有一个荧光淬灭基团MGB。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供一种基于微滴式数字PCR的三七粉定量检测方法，建立三七粉质量与DNA浓度、DNA浓度与基因拷贝数关系，以DNA浓度为中间量构建基因拷贝数和三七粉质量关系，进而测定三七粉含量。包括使用针对三七源性成分的特异性引物和探针组合。

进一步地，该检测方法包括如下步骤：