[发明专利]一种经修饰荧光探针及其应用

说明书

本发明提供一种寡核苷酸探针，其包含寡核苷酸分子和与所述寡核苷酸分子结合的标记物，其中，所述寡核苷酸分子包含：能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区，所述标记物（a）当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号，或（b）当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。

技术领域

本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及荧光探针领域，更具体包括经修饰荧光探针、其制备方法和应用。

背景技术

荧光探针技术是基于荧光共振能量转移基础，用于核酸定性、定量的检测技术。含有某种特异序列的核苷酸序列上包含一对荧光物质，其中一个是能量的供体，另一个为能量的受体。当供体和受体在空间上足够近时，激发供体产生的荧光能量被受体吸收，检测器只获得一个本底背景荧关信号。在荧光PCR检测过程中，通过把目的核酸序列含量与供体、受体空间距离变化带来的荧光信号改变进行正向关联的方式，进行目的核酸的定性、定量检测。

目前常用的荧光探针技术，主要包括水解探针法（包括Taqman技术和MGB技术）和杂交探针法（包括双杂交探针和分子信标技术）。Taqman水解探针在检测靶位点完全匹配的序列基础上，5’端加上荧光报告基团，3’端加上淬灭基团，常见的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、CY5等，常见的淬灭基团有TAMRA、BHQ等。在未进行PCR检测时，荧光基团和淬灭基团空间位置很近，荧光基团因淬灭而不产生荧光。PCR检测退火过程中探针结合到目标序列上，扩增Taq酶延伸到探针结合位置时，其5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，荧光基团释放，产生荧光信号。随着目标序列的增加，被Taq酶降解的探针越多，产生的荧光信号也就越多。从而可以进行扩增曲线绘制和定量。

分子信标技术是另一种常见荧光探针设计方式，其两端的核酸序列互补配对，形成茎环结构，茎部分的序列与检测靶位点序列无关但具备互补性，使两端标记的荧光基团和淬灭基团空间位置紧紧靠近，具有本底信号低的特征。探针的环状位置是目标位点识别序列。分子信标探针不依赖于扩增过程中Taq酶的降解，而是在检测过程中打开茎环结构，当环状位置序列与目标序列结合时，保持整个探针是打开状态，使得荧光基团和淬灭基团空间位置分开，从而产生可检测的荧光。

DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，已有研究发现DNA甲基化参与到众多生命过程的调节，特别是与肿瘤的发生、发展相关。目前已有众多DNA甲基化检测技术，这其中基于亚硫酸氢盐转化后的荧光PCR检测，依然是对已知靶点检测最实用的一项技术。经亚硫酸氢盐处理后的DNA序列，其碱基平衡性差，DNA损伤断裂多，因而PCR检测的难度相对常规检测大，检测特异性和准确性低。因此需要背景信号弱、灵敏度高同时具备特异性高的一种荧光PCR检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是在于提供一种特异性强、背景信号弱的荧光探针。

具体而言，本发明第一方面提供一种寡核苷酸分子，包含：能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区。

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸分子用于与靶核酸杂交。

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸分子还包含位于靶核酸识别区和靶核酸识别类似区之间的接头区。

在一个或多个实施方案中，自互补区包括5’末端互补区、3’末端互补区，

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸分子从5’至3’依次包含：5’末端互补区、靶核酸识别区、接头区、靶核酸识别类似区、与5’末端互补区互补的3’末端互补区。