[发明专利]一种指数扩增反应触发3-D双腿DNA步行器的microRNA生物传感器

权利要求书

1.制备一种指数扩增反应触发3-D双腿DNA步行器的microRNA生物传感器，按以下步骤操作：

(1)、等温指数扩增反应(EXPAR)首先，将100nM模板，各种浓度的靶标microRNA，1μL 10×CutSmart缓冲液和1μL 10×NEBuffer 2混合，并在95℃水浴中加热5分钟，然后缓慢降低至室温。然后，将0.2U的KF聚合酶，1U的Ns.BsmAI，250μM dNTP和DEPC处理水添加到混合物中，使得最终体积为10μL。扩增反应在37℃下进行30分钟。最后，通过在80℃下20分钟的酶灭活处理终止反应体系。将该溶液储存在4℃下以备将来使用。

(2)、DNA步行器探针的制备将50μL链霉亲和素包被的微球用50μL结合缓冲液洗涤两次，方法是将微球以12000rpm离心3分钟，然后弃去上清液。用50μL结合缓冲液重悬后，将5μL 20μM生物素修饰的轨道链添加到微球中。将混合物在37℃下孵育20分钟。然后将上述溶液在12000rpm下离心3分钟，除去上清液后，将剩余溶液用50μL TE缓冲液洗涤3次。最后，将微球复合物悬浮于50μL TE缓冲液中。

(3)、microRNA的荧光测量对于典型的步行器操作，反应溶液在100μL反应体积中于37℃进行20分钟，包括10μL EXPAR产品，5μL制备的微球复合物，在1×CutSmart缓冲液中的10U Nb.BbvCI内切酶。将反应溶液在12000rpm下离心3分钟后，收集上清液以测量荧光信号。

2.如权利要求1所述的基于指数扩增反应触发的3-D双腿DNA步行器的生物传感器，其制备方法步骤(1)中所用KF聚合酶浓度是0.2U/10μL。

3.如权利要求1所述的基于指数扩增反应触发的3-D双腿DNA步行器的生物传感器，其制备方法步骤(1)中EXPAR反应时间为30分钟。

4.如权利要求1所述的基于指数扩增反应触发的3-D双腿DNA步行器的生物传感器，其制备方法步骤(2)中加入轨道连的量是5μL 20μM。

5.如权利要求1所述的基于指数扩增反应触发的3-D双腿DNA步行器的生物传感器，其制备方法步骤(2)中最后用50μL TE缓冲液洗涤3次并定容。

6.如权利要求1所述的基于指数扩增反应触发的3-D双腿DNA步行器的生物传感器，其制备方法步骤(3)中反应体积是100μL。

7.如权利要求1所述的基于指数扩增反应触发的3-D双腿DNA步行器的生物传感器，其制备方法步骤(3)中37℃进行20分钟酶促反应。