[发明专利]一种指数扩增反应触发3-D双腿DNA步行器的microRNA生物传感器

说明书

本专利使用内切酶驱动的三维(3‑D)DNA步行机设计了一种DNA放大器，其中，双腿DNA步行器(BDW)通过靶标miRNA触发的指数扩增反应(EXPAR)可以连续组装到荧光标记的聚苯乙烯微球轨道上。根据比较研究，我们首先证明了BDW的行走速度比单腿DNA步行器(SDW)快。鉴于此，EXPAR由靶标miRNA借助聚合酶和切口内切核酸酶启动以在溶液中生成大量BDW，从而在切口内切核酸酶存在的情况下激活步行器，在上清液中产生增强的荧光信号。以microRNA 21为模型目标，该方法在最佳条件下的检测限低至5.2fM，与其他DNA步行器相比，具有更高的灵敏度。溶液中的酶辅助的EXPAR和粒子上的酶促BDW的结合可显着提高信号放大效率并提高检测灵敏度。因此，我们的方法对于与BDW相关的生物传感器的应用具有巨大的潜力。

技术领域

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种基于指数扩增反应触发的3-D双腿DNA步行器用于microRNA检测。

背景技术

DNA纳米技术在分析化学领域取得了令人瞩目的进步。受自然启发，DNA步行器作为DNA纳米技术的重要分支，可模拟天然分子步行器，例如动力蛋白，肌球蛋白和驱动蛋白。对于典型的DNA步行器，它包含三个基本组件，即步行链，步行轨道和驱动马达。在步行过程中，DNA步行器可以沿着不同维度的轨道产生大量信号分子用于信号放大。然而，一维(1-D)轨道和二维(2-D)DNA折纸都具有非常有限的持续性和行走空间，这限制了此类DNA步行机器的执行能力。为了解决上述问题，研究人员最近在微球或纳米颗粒表面建立了3-D轨道。由于增加了局部有效浓度，因此与1-D和2-D轨道相比，这种3-D轨道可以增加行走步数和提高持续性。同时，研究人员也探索了DNA步行器的多种驱动方式。其中，采用高活性核酸工具酶具有卓越的能力。一方面，这归因于酶的天然高催化能力。另一方面，由于颗粒内的相互作用和局部底物浓度的增加，颗粒的生物催化作用可加速酶促反应。

值得注意的是，上述的DNA步行器将一个摆臂链固定在纳米颗粒的表面，这限制了DNA步行器的运动范围和效率。此外，在同一个微球或纳米颗粒表面上构建两种不同的探针，由于摆臂链的占据，不仅减少了轨道DNA的局部浓度，还增加了制造不同浓度比的多个DNA探针的难度。为了解决这个问题，研究者提出了双腿DNA步行器策略以提高步行效率。例如，有研究小组开发了一种自下而上的方法来组装能够探测和控制AuNPs生物纳米界面上的动态相互作用的双腿DNA步行器。这种方法成功地为双腿DNA步行器的设计提供了更好的理解。

除了粒子上的生物催化外，强大的生物识别组件的构建对于3-D DNA步行器同样重要。据报道，与粒子上生物识别相比，溶液中的生物识别可以更好地制造，预测，控制和执行。另一方面，靶分子的常规分析仅产生一个DNA步行器，从而限制了步行器的总数及其步行效率。因此，需要一种将生物识别和扩增结合在一起的方法。近年来，等温扩增策略已成为核酸、蛋白质和其他分子分析的有力工具。其中，指数扩增反应(EXPAR)由于放大效率高(10⁶-10⁸)和操作简单等突出优点，在灵敏传感器的设计中受到关注。通过聚合酶和核酸内切酶的介导，EXPAR可以在短时间内(30分钟)激活特定引物来扩增大量单链DNA(ssDNA)。本发明结合了溶液中的EXPAR扩增和微粒子上的酶切反应。EXPAR作为第一个反应在引入目标microRNA时触发并且伴随着大量ssDNA的释放。ssDNA充当双腿DNA步行器，然后连续组装到DNA修饰的聚苯乙烯微球表面上。之后加入核酸内切酶来激活DNA步行器，其围绕轨道执行机械化和逐步的运动，从而引起持续的荧光信号输出。

发明内容

本发明的目的是开发出一种简单、灵敏的microRNA生物传感器。

具体技术方案如下：