[发明专利]刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法

说明书

本发明涉及刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法。获取刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列，通过对这些序列进行多重比对，获得相对保守的区域以及变异较大的区域，在相对保守的区域设计相互嵌套引物，即第一对引物的下游引物应在第二对引物的上游引物之后，保证扩增出的产物之间相互重叠。由此获得的刺鮈线粒体基因组全序列的扩增引物可用于种类鉴定、地理种群鉴别和种质资源评估等方面。

技术领域

本发明属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法。

背景技术

刺鮈(Acanthogobio guentheri Herzenstein)属鲤形目、鲤科、鮈亚科、刺鮈属、别名金鱼(青海民和)，小型鱼类，是刺鮈属唯一种，为中国特有鱼类。刺鮈体较高而侧扁，背鳍前部较隆起，腹部圆，尾柄粗短。头短而尖，头长通常小于体高。吻尖，呈锥形，吻长稍短于眼后头长。口下位，呈弧形，唇简单，无乳突。唇后沟中断。背鳍最后不分枝鳍条为一光滑的硬刺，端部柔软，其长度较头长为短。胸鳍长，个体较小者末端可伸达腹鳍起点。腹鳍位于背鳍起点稍后的下方，末端不达臀鳍。臀鳍短，无硬刺，其起点距腹鳍基较距尾鳍基稍近。尾鳍分叉，两叶，末端尖。肛门靠近臀鳍起点。侧线完全，平直。体背部呈褐色或淡褐色，背部正中有一条黑色的条纹。体侧中轴之上方有一列黑色斑点。背鳍和尾鳍呈灰黑色，并具黑色斑点，其他各鳍灰白色。据记载，在青海共和曲沟至甘肃兰州等黄河干支流均有分布，是黄河上游重要的土著鱼类资源。黄河青海段土著鱼类体表具明显鳞片的鱼类只有三种，鲤科雅罗鱼亚科黄河雅罗鱼、鲤科鮈亚科黄河鮈和刺鮈。

鱼类线粒体基因组由13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因(12S rRNA及16S rRNA)共37个编码基因及一段主要的非编码区(控制区)组成，具有结构简单、拷贝数多、严格的母系遗传、几乎不发生重组、编码效率高、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点。由于鱼类线粒体基因组所具有的这些特点，使其在种类鉴别、系统进化和种群遗传学的研究方面应用十分广泛。

由于拦河筑坝、水体污染、过度捕捞等人为因素干扰以及刺鮈生活环境的改变，刺鮈个体趋于低龄化、小型化，且鱼类资源量急剧下降，遗传多样性降低。鲤科雅罗鱼亚科黄河雅罗鱼和鲤科鮈亚科黄河鮈在青海境内已基本采集不到，仅剩下刺鮈目前在十分有限的水域分布，已列入《中国物种红色名录》易危物种。目前，必须采取有效的措施来保护和恢复急剧衰退的刺鮈自然群体资源。但现阶段，关于刺鮈的研究，主要集中于蛋白质组学和资源生物学领域，而采用分子生物学技术对刺鮈的研究不多，且关于其线粒体基因组全序列扩增的引物和方法尚未报道。考虑到目前刺鮈遗传学尤其是线粒体基因组方面的信息量有限，开展其线粒体基因组全序列的研究就显得十分必要。

发明内容

针对现有技术的空白，本发明提供了一种刺鮈线粒体基因组全序列的引物设计及其扩增方法。利用该引物可一次性扩增出刺鮈线粒体基因组，通过测序和拼接能够快速获得其基因组全序列，该方法具有简便、快捷、高效等优点。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种刺鮈线粒体基因组全序列扩增引物的设计方法，获取刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列，通过对这些序列进行多重比对，获得相对保守的区域以及变异较大的区域，在相对保守的区域设计相互嵌套引物，即第一对引物的下游引物应在第二对引物的上游引物之后，保证扩增出的产物之间相互重叠。

按上述方案，所述刺鮈近缘物种为薄身罗马诺鮈(Romanogobio tenuicorpus)、蛇鮈(Saurogobio dabryi)、犬首鮈(Gobio cynocephalus)、似鮈(Pseudogobio vaillanti)。

按上述方案，所述刺鮈近缘物种的线粒体基因组全序列从Genbank数据库中下载获得。

按上述方案，所述的相对保守的区域为无突变位点或仅1个突变位点的保守序列区域