[发明专利]一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法

说明书

本发明涉及生物领域，具体公开了一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法，用含有聚乙二醇和核苷酸二钠盐水溶液的双水相混合液从含有核酸酶P1的粗酶液中萃取纯化核酸酶P1。本本发明方法能够高效的分离纯化核酸酶P1，核酸酶P1的酶回收率达87.6％；而且成本低廉、可适用于大规模产业化生产。另外，本发明方法所获得的核酸酶P1纯度大大提高，比活比粗酶提高4.6倍、杂质少，所以可用于食品工业。同时，双水相成分PEG和核苷酸二钠均可回收利用，大大降低成本。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法。

背景技术

5'-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中，己经由最初的食品助鲜剂扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中，尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生。在医药领域，5'-核苷酸不但能够作为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料。此外，核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂，有着明显的增产、增重功效。

在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一种能够水解RNA获得四种5'-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。但是核酸酶P1粗酶含有较多杂酶，对于酶解的效率影响较大，一般需要进行纯化后使用。

目前采用硫酸铵盐析法、离心喷雾干燥法等分离核酸酶P1的方法存在样品回收率低、分离材料或设备昂贵、样品处理量小、单一方法分离纯度低的问题；而且经硫酸铵盐析法分离方法得到的核酸酶P1含有较多杂质，效价低，且不能直接应用于食品工业中。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种双水相萃取纯化核酸酶P1的方法，用含有聚乙二醇和核苷酸二钠盐水溶液的双水相混合液从含有核酸酶P1的粗酶液中萃取纯化核酸酶P1。

其中，所述的聚乙二醇分子量为1000～5000，优选为2000～3000，进一步优选为3000。

其中，所述的核苷酸二钠为鸟苷酸二钠(GMPNa₂)、腺苷酸二钠(AMPNa₂)、肌苷酸二钠(IMPNa₂)、尿苷酸二钠(UMPNa₂)和胞苷酸二钠(CMPNa₂)中的任意一种或几种组合，优选为AMPNa₂、IMPNa₂和GMPNa₂中的任意一种或几种组合，进一步优选为GMPNa₂和IMPNa₂中的任意一种或几种组合，更进一步优选为GMPNa₂。

其中，所述的双水相混合液中，聚乙二醇、核苷酸二钠盐和水的质量百分比为20～35:25～40:30～50，优选为28:32:40。

其中，所述的含有核酸酶P1的粗酶液为桔青霉发酵所制得的；其中，所述的桔青霉(Penicillium citrinum)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2014，已公开于申请号为200710022932.6的专利中。

其中，所述的含有核酸酶P1的粗酶液中核酸酶P1的酶活为4000～6000U/mL。

其中，所述的双水相混合液与含有核酸酶P1的粗酶液的质量比为0.5～1:1，优选为1:1。

优选地，将双水相与含有核酸酶P1的粗酶液混合后，调节pH为5.0～8.0，优选为6.0，静置分层，收集上层液相和下层液；将上层液相用水稀释后，用超滤膜超滤，所得截留物即为纯化的核酸酶P1，透过液为含有聚乙二醇的液体，可回收使用。