[发明专利]猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测猪星状病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反应液，所述的PCR反应液包括引物对、TaqMan探针、2×PrimDirect Probe RT‑Qpcr Mix with UNG等。所述的试剂盒还包括标准品。本发明还公开了一种所用所述试剂盒检测猪星状病毒2型的方法以及该试剂盒在猪星状病毒2型诊断中的应用。本发明所述的试剂盒特异性好、灵敏度高、重复性好。可以为PAstV2的流行病学调查以及检测诊断PAstV2提供准确、可靠的技术工具。

技术领域

本发明涉及猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR及其应用，属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。

背景技术

星状病毒是一种无囊膜包被的单股正链RNA病毒，其基因组全长约6.4kb～7.3kb。星状病毒的宿主范围极广，可感染人、猪、牛、犬、猫等多种哺乳动物，以及鸡、鸭、火鸡等禽类动物。猪在感染星状病毒后常常表现为无症状或轻微腹泻等临床症状，因而被认为是一种腹泻相关病原。猪星状病毒目前可分为5个基因型(PAstV1～PAstV5)，遗传进化分析结果显示，各基因型可能存在不同的进化祖先。流行病学调查结果显示，PAstV在我国猪群内的流行率较高，且5个基因型均有发现。因此，建立一种快速、准确的PAstV2实验室诊断方法，对于了解PAstV2在我国猪群中的流行情况具有重要意义。本发明旨在建立一种可以快速、准确地检测PAstV2的TaqMan荧光定量PCR方法，并以此为基础制备试剂盒，为PAstV2的流行病学调查以及检测诊断PAstV2提供准确、可靠的技术工具。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速、准确地检测PAstV2的TaqMan荧光定量PCR的试剂盒。

因此，本发明一方面提供了一种猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测猪星状病毒2型ORF1ab保守基因序列的PCR反应液，所述的PCR反应液包括引物对和Taqman探针，所述引物对和TaqMan探针的序列如下：

PAstV2-F：5’-CTGCGCCTACCACCGCGCAGGAGG-3’；

PAstV2-R：5’-CGAGAGTCCTCVAGGAAGTTGTA-3’；

PAstV2-probe：5’-FAM-TACCACCATGTGACCCAGACCTNCCYTTC-3’BHQ1。

优选地，本发明所述的猪星状病毒2型Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1淬灭基团。

优选地，本发明所述的PCR反应液还包括2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mixwith UNG

优选地，本发明所述的试剂盒的反应体系为2×PrimDirect Probe RT-Qpcr Mixwith UNG 12.5μL，PAstV2-F、PAstV2-R各0.5μL，PAstV2-probe 0.5μL，处理后样本2μL，灭菌水补齐至25μL。

优选地，本发明所述的试剂盒还包括标准品，所述标准品为猪星状病毒2型阳性样品cDNA扩增片段回收纯化后克隆至pMD18-T中所得，所述标准品浓度为1.4×10⁷copies/μL、1.4×10⁶copies/μL、1.4×10⁵copies/μL、1.4×10⁴copies/μL、1.4×10³copies/μL、1.4×10²copies/μL。

优选地，本发明所述的标准品中目的片段的序列如SEQ ID NO.1所示。