[发明专利]一种用于表达角鲨烯合成酶的载体及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于表达角鲨烯合成酶的载体及其构建方法和应用。所述载体包含强启动子pTAC控制下的角鲨烯合酶基因hSQS，hSQS基因通过依据参照大肠杆菌密码子偏好性所优化以提高蛋白表达量。本发明为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的载体工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于表达角鲨烯合成酶的载体及其构建方法和应用。

背景技术

角鲨烯(Squalene)，又称三十碳六烯，是一种不饱和脂肪烯烃。角鲨烯是所有细胞中甾醇的前体，是一种非常重要的功能油脂，具有强携氧能力、抗氧化、抗辐射、解毒作用、抑制微生物的生长、调控动物体中胆固醇的代谢以及防癌和抗癌作用等重要生理活性，在食品、医药、化妆品等领域具有包括以下方面的广泛应用：①角鲨烯抗氧化、抵御紫外线伤害，可用作化妆品；②角鲨烯可作为药物缓释剂，增强药物的治疗效果；③角鲨烯可摄取大量的氧，加强细胞新陈代谢消除疲劳，已成为功能明确的活性成分，在功能性食品中应用广泛；④角鲨烯是一种良好的自由基清除剂，因其具有抗氧化、降血糖、降血脂等生物活性，可用于保健品的生产加工，如角鲨烯软胶囊(角鲨烯含量为100-500mg/粒)等；⑤角鲨烯常被添加于大豆油、花生油等食用植物油中，抑制或延缓油脂的氧化，从而提高食用植物油的稳定性，延长产品的货架期。

通常情况下，角鲨烯大量存在于深海鲨鱼肝脏中，本着保护动物、保护环境的理念，研究人员都在积极探索其他角鲨烯来源。此外，海洋动物肝脏中存在的类似化合物，如胆固醇，使角鲨烯纯化困难，难以大规模生产应用。角鲨烯也可以从植物来源获得，但由于含量低，纯化条件复杂，难以满足制药和工业应用的需求。

由于微生物发酵存在着生长周期短，产量高、培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，受环境因素限制小等优点，因而成为目前国际上的一个新研究领域。

角鲨烯的前体物质为法尼基二磷酸酯(FPP)，主要有两种合成途径：甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径和甲羟戊酸(MVA)途径，其中MEP途径主要存在于植物、细菌和藻类等，而MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中。

大肠杆菌不含有角鲨烯合酶基因但具有角鲨烯合成前体物质法尼基焦磷酸合成途径，更有利于活性验证及代谢途径改造，同时大肠杆菌基遗传背景清楚，易于培养，繁殖速度快，是良好的模式生物。

发明内容

本发明的技术目的是通过构建载体以便在大肠杆菌中引入角鲨烯合成酶基因从而高效生产角鲨烯。

本发明的另一目的是提供通过微生物发酵法生产角鲨烯的方法，其中，所述方法利用上述构建的载体。

一方面，本发明提供一种用于表达角鲨烯合成酶的载体，其含有角鲨烯合成酶基因，特别是优化的角鲨烯合成酶基因(SEQ ID NO：9)。

在具体实施方式中，所述载体含有强启动子pTAC，以控制角鲨烯合酶基因。

在具体实施方式中，所述载体的序列为SEQ ID NO：8。

另一方面，本发明提供一种上述载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：

1).构建重组质粒pTYT，

其中，以质粒载体pET-28b(+)为模板并进行反向PCR获得线性化载体片段H1，以质粒载体pRG为模板通过PCR获得片段H2，将H1、H2通过Gibson Assembly方法连接，得到重组质粒pTYT；

2).构建pTYT-hSQS载体，

通过Golden Gate组装将hSQS片段H3(优选SEQ ID NO：9)与重组质粒pTYT连接，得到重组载体pTYT-hSQS。

在具体实施方式中，在步骤1)中，使用的引物的序列如下：