[发明专利]铜离子诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法

说明书

本发明涉及一种铜离子诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法，其构建方法包括：将酿酒酵母菌中的Gal80启动子替换为内源性CTR3或CTR1铜离子抑制启动子，将酿酒酵母菌中的Gal4启动子替换为内源性CUP1铜离子诱导启动子，以便获得重组酿酒酵母菌。采用上述方法构建得到的酿酒酵母工程菌可利用廉价铜离子作为诱导剂，实现酿酒酵母可控表达蛋白，并且具有较好的菌株稳定性。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种铜离子诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法。

背景技术

酿酒酵母表达系统是外源蛋白表达系统之一，常见有持续型表达系统和诱导型表达系统两种。通常持续型表达系统采用糖酵解路径的强启动子(比如GPD、PGK等)、转录因子相关启动子(比如TEF1、TEF2等)，其由于目标蛋白持续表达，对菌体在对数生长期的负担较大，从而造成菌体生长受阻、蛋白量表达量不高等问题，且持续表达容易引起菌株不稳定，不利于工业用途。诱导型表达系统使用较多的是半乳糖诱导型表达系统：该系统在葡萄糖作为碳源被抑制，只有当碳源转变为半乳糖时才诱发目标蛋白表达，所以其缺点是存在着半乳糖成本高，增加额外生产成本。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种铜离子诱导的酿酒酵母工程菌及其构建方法。该工程菌利用廉价铜离子作为诱导剂，实现酿酒酵母可控表达蛋白，并且具有较好的菌株稳定性。

为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种铜离子诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，其包括：

将酿酒酵母菌中的Gal80启动子替换为内源性CTR3或CTR1铜离子抑制启动子，将酿酒酵母菌中的Gal4启动子替换为内源性CUP1铜离子诱导启动子，以便获得重组酿酒酵母菌。

根据本发明实施例的铜离子诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，该方法通过将酿酒酵母菌中的Gal80启动子替换为CTR3或CTR1铜离子抑制启动子，将Gal4启动子替换为CUP1铜离子诱导启动子，实现常规半乳糖诱导表达系统(比如GAL1/10表达系统)转变为可控铜离子诱导系统，使得构建的表达系统可通过铜离子的诱导，实现以葡萄糖等碳源作为原料表达目标蛋白，用于蛋白过表达或生物合成等用途。

另外，根据本发明上述实施例提出的铜离子诱导的酿酒酵母工程菌的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：

可选地，所述CTR3铜离子抑制启动子是以酿酒酵母基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CTR3_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CTR3_rev为引物，经PCR扩增得到。

可选地，所述CTR1铜离子抑制启动子是以酿酒酵母基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CTR1_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CTR1_rev为引物，经PCR扩增得到。

可选地，所述CUP1铜离子诱导启动子是以酿酒酵母基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的CUP1_fwd和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的CUP1_rev为引物，经PCR扩增得到。

可选地，所述CTR3或CTR1铜离子抑制启动子是通过CRISPR/Cas9无痕敲入技术替换酿酒酵母菌中的Gal80启动子。

可选地，还包括将外源蛋白基因的表达载体转化至所述重组酿酒酵母菌，以便获得重组酿酒酵母工程菌。

在本发明的第二个方面，本发明提出由上述工程菌的构建方法构建得到的铜离子诱导的酿酒酵母工程菌。

根据本发明实施例的酿酒酵母工程菌，可实现利用廉价铜离子作为诱导剂，实现酿酒酵母可控表达蛋白，并且具有较好的菌株稳定性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。