[发明专利]一种普卡那肽的制备方法

权利要求书

1.一种普卡那肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将起始树脂、FMPB和缩合试剂混合，进行改性，得到改性树脂；所述起始树脂包括MBHA树脂或AM树脂；

(2)在保护气氛下，将所述改性树脂、H-Leu-OtBu和呋喃类溶剂混合，进行氨醛缩合反应，将所得席夫碱与还原剂混合，进行还原反应，得到H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂；

(3)按照普卡那肽主链肽的序列，在所述H-Leu-OtBu-FMPB MBHA/AM树脂上依次连接Fmoc-Cys(Acm)-OH、R₁-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、R₂-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到全保护普卡那肽树脂；所述R₁和R₂独立地包括Fmoc和/或Fmoc-Hmb，所述R₁和R₂不同时为Fmoc；所述连接包括依次进行的偶联反应和脱Fomc保护基反应；

(4)将所述全保护普卡那肽树脂在裂解液中进行裂解，得到普卡那肽线肽；

(5)将普卡那肽线肽溶解于试剂中，将得到的普卡那肽线肽溶液的pH值调节至7～10后与第一氧化剂混合，对所述普卡那肽线肽序列中4位和12位的Cys中的二硫键进行第一氧化成键，得到预氧化普卡那肽线肽；

所述第一氧化剂包括空气、过氧化氢或二甲基亚砜；

(6)将所述预氧化普卡那肽线肽进行柱色谱粗纯化，将得到的纯化液进行稀释后和第二氧化剂混合，对所述预氧化普卡那肽线肽序列中的7位和15位的Cys中的二硫键进行第二氧化成键，将得到的第二氧化产物进行反相制备色谱纯化，得到普卡那肽；

所述柱色谱粗纯化采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括醋酸水溶液、三氟醋酸水溶液、磷酸三乙胺水溶液或乙酸铵水溶液，所述流动相B包括乙腈、甲醇或乙醇；

所述第二氧化剂包括碘、二价汞盐、银盐或三价钛盐。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述起始树脂的取代度为0.3～1.6mmol/g；

所述缩合试剂包括HOBT-DIC、HBTU-NMM、HATU-NMM或PyBOP-HOBT-NMM；

所述起始树脂、FMPB和缩合试剂的摩尔比为1：(1.5～4)：(1.5～4)。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述改性树脂和H-Leu-OtBu的摩尔比为1：(1～6)；

所述氨醛缩合反应在酸性或碱性条件下进行，所述酸性条件的pH值为2～6，所述碱性条件的pH值为7.5～11。

4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠和醋酸硼氢化钠中的一种或几种；

所述改性树脂和还原剂的摩尔比为1：(2～6)。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述偶联反应采用的缩合试剂包括HOBT-DIC、HBTU-NMM、HATU-NMM或PyBOP-HOBT-NMM；

所述脱Fomc保护基反应采用的脱保护试剂包括哌啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯或三乙胺。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述裂解液的组成包括TFA、EDT、TIS和H₂O，所述TFA、EDT、TIS和H₂O的体积比为(85～100)：(0～5)：(0～5)：(0～5)；

所述全保护普卡那肽树脂的质量和裂解液的体积之比为1g：(3～15)mL；

所述裂解的温度为15～35℃，时间为2～6h。