[发明专利]基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸

权利要求书

1.一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法,其特征在于，包括下述步骤：

(1)均一粒径胶体金的制备：使用水热法制备均一粒径的胶体金纳米粒子；

(2)高荧光猝灭性能AuNP@hDNA-BHQ2探针的制备：通过金巯键反应将SH-DNA-BHQ2与AuNP反应，制得到的两种AuNP@hDNA1-BHQ2探针；AuNP@hDNA1-BHQ2探针以及AuNP@hDNA2-BHQ2探针,其中AuNP@hDNA1-BHQ2与miRNA-5010互补杂交配对,AuNP@hDNA2-BHQ2与miRNA-331互补杂交配对；

(3)Klenow聚合酶实现链置换等温扩增：miRNA-5010和miRNA-331分别通过核酸杂交打开对应的hDNA的配对茎序列；生物素标记引物Biotin-Primer和地高辛标记引物Digoxin-Primer与相应被打开的hDNA的茎序列杂交，引物在Klenow聚合酶的帮助下进行延伸，逐渐取代目标miRNA，并与打开的hDNA完全杂交形成dsDNA双链序列，在AuNP的表面分别形成了dsDNA1-BHQ2-Biotin或dsDNA2-BHQ2-Digoxin，被取代的miRNA-5010或miRNA-331释放出来，循环参与扩增反应得到大量的AuNP@dsDNA1-BHQ2-biotin或AuNP@dsDNA2-BHQ2-digoxin反应液，实现信号放大。

(4)核酸试纸条的组装和检测：将所需的SA-Cy5、Digo-Ab-Cy3和羊抗鼠二抗通过划线仪分别划线到硝化纤维素膜上，并将试纸条卡壳和样本垫、胶金垫、检测垫、吸收垫组装起来，形成核酸试纸条；将上述反应步骤(3)产生的反应液加入到组装好的核酸试纸条上，反应一段时间后得到相应结果。

2.根据权利要求1所述的基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法,其特征在于，hDNA1-BHQ2为5’-AACACATCGTCCCTGGGGAATGGGAGACACAAAAGGACGATGTG-BHQ2-3’；hDNA2-BHQ2为5’-AATGTGCTACGGGGATCCCTGGGACCATACCTAGCCGTAGCACA-BHQ2-3’。

3.根据权利要求1所述的基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法,其特征在于，步骤(1)的具体步骤为：将50-100mL的2-5mM柠檬酸钠水溶液添加到三颈烧瓶中并加热至沸腾；同时在不断搅拌下将1-5mL的10-30mM HAuCl4·4H2O添加到沸水中。加热10min后，溶液的颜色逐渐变为酒红色，使溶液缓慢冷却至室温；将上述反应制备的金种子加热到90℃后，分多次加入将5-10mL的10-30mM HAuCl4·4H2O添加到溶液中，最终制备得到的胶体金纳米粒子溶液粒径为13-40nm。

4.根据权利要求1所述的基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法,其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：取10-50μL的浓度为10-50μM的SH-hDNA-BHQ2探针，加入10-50μL的浓度1-10mM的三(2-羧乙基)膦TCEP溶液，活化1-3h后，加入1-5mL的步骤(1)中制备的均一粒径纳米粒子，旋转培养反应6-24小时；之后加入10-100μL的8μg/μL的HCG鼠源单克隆抗体MIgG，反应1-5h；再加入0.1-0.5mL的浓度为3M的氯化钠溶液，置于4℃反应过夜后，在8000-15000转速条件下离心15-30min，除去上清，用0.1-0.5mL的0.01M磷酸缓冲溶液PBS重悬沉淀，得到的则为AuNP@hDNA-BHQ2探针。

5.根据权利要求1所述的基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法,其特征在于，步骤(3)的具体步骤为：在30-100μL溶液中进行，该溶液由10-20μL的待测目标样品、0.5-2μL Klenow聚合酶、10-20μL Biotin/Digoxin-Primer、AuNP@hDNA-BHQ2、10-20μL 0.5mM dNTPs、10-20μL 2％DMSO和10-20μL 0.01M PBS的反应缓冲液组成；混合溶液在37℃中孵育20-40min后实现等温扩增。