[发明专利]基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸

说明书

本发明属于miRNA检测领域，尤其是涉及一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸，包括下述步骤：(1)均一粒径胶体金的制备：(2)高荧光猝灭性能AuNP@hDNA‑BHQ2探针的制备；(3)Klenow聚合酶实现链置换等温扩增；(4)核酸试纸条的组装和检测：实现样品中miRNA的高效特异性检测，通过SH‑hDNA‑BHQ2的核苷酸序列和不同的引物设计协同作用，可以从待测样品中高特异性的检测出目标miRNA，实现高特异性检测。

技术领域

本发明属于miRNA检测领域，尤其是涉及一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸。

背景技术

包括帕金森病(PD)和阿尔兹海默症(AD)在内的神经退行性疾病对全球2-3％的老年人群产生了重大影响。运动障碍帕金森病评分表(MSD-UPDRS)等评估量表是临床常用的神经退行性疾病诊断方法，量表法主要通过医生基于症状组合的识别进行主观诊断评估，临床上尚缺乏客观的生化分析方法对神经性退行性疾病进行体外检测。近来一些研究表明，miRNA-5010和miRNA-331在神经退行性疾病尤其是帕金森病人的全血样本中显著上调，因此，准确定量miRNA-5010和miRNA-331对帕金森病的早期筛查与诊断具有重要意义。传统的基于miRNA的检测如基因测序、荧光定量PCR等，但是这些检测方式毫无例外都需要大型的仪器配合，不仅费时、费力，而且只适合医院等一些检测机构，无法造福于每个家庭以实现便携、惠民大众化。因此miRNA-5010和miRNA-331的早期简便检测已经成为现今的研究热点。

胶体金核酸试纸条是一种对复杂样品中目标物质进行检测的固相免疫分析方法，其主要原理如下：利用胶体金标记一种短的DNA序列，与目标物质核酸反应形成复合物，由于毛细管作用在固相层析膜上涌动，被检测线上的DNA序列捕获，形成肉眼可见的T线。一定条件下，T线信号强弱与目标核酸浓度正相关，将胶体金免疫层析检测试纸条联合胶体金读取仪的方法，根据反射光度法原理，可以快速、准确、简单的对相关物质进行定量或者半定量检测，胶体金核酸试纸条已成为一种核酸即时检验(Point-of-caretesting,POCT)方法。

近年来，研究者将核酸检测的关注点集中在POCT技术的开发应用上，从而实现核酸标志物的现场检测。反向荧光增强试纸条(rLFTS)基于金纳米粒子(AuNP)可以肉眼定性和定量荧光猝灭信号，与传统荧光增强试纸条(LFTS)相比具有更低的检测限(LOD)，AuNP检测探针的荧光淬灭是rLFTS灵敏度提高的主要因素。黑洞淬灭剂(BHQ)是一类高效荧光淬灭剂，因此，制备BHQ2标记的AuNP将有助于增强探针的荧光猝灭特性，从而提高rLFTS的灵敏度。

链置换等温扩增技术是一种基于酶促反应的核酸体外等温扩增技术，该技术通过内切酶对目标DNA的未修饰链进行切口，然后通过聚合酶在DNA切口的3’端延伸并置换下游DNA链的反应，将置换的DNA链充当反义反应的模板，目标DNA获得指数扩增，有助于miRNA的灵敏检测。其中，“入侵堆叠引物”链置换等温扩增反应(ISAR)显示了miRNA灵敏检测的独特优势，实现连续堆叠杂交和置换反应，显著提高等温扩增效率。

发明内容

本发明提出了一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法及检测试纸，具体技术方案如下；

一种基于链置换等温扩增技术及反向荧光增强技术检测miRNA的方法,包括下述步骤：

(1)均一粒径胶体金的制备：使用水热法制备均一粒径的胶体金纳米粒子；

(2)高荧光猝灭性能AuNP@hDNA-BHQ2探针的制备：通过金巯键反应将SH-DNA-BHQ2与AuNP反应，制得到的两种AuNP@hDNA1-BHQ2探针；AuNP@hDNA1-BHQ2探针以及AuNP@hDNA2-BHQ2探针,其中AuNP@hDNA1-BHQ2与miRNA-5010互补杂交配对,AuNP@hDNA2-BHQ2与miRNA-331互补杂交配对；