[发明专利]机械法分离鱼类精原干细胞的方法

权利要求书

1.一种机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用剪刀将性腺剪切成组织块，并用缓冲液洗涤；

2)将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪碎，再用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀；

3)将步骤2)的细胞沉淀用液体培养基重悬，过滤，得到富含精原干细胞的细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤3)中，液体培养基为含1～10％胎牛血清的DMEM:F-12培养基或含1～10％胎牛血清的L-15培养基。

3.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，洗涤时，向装有组织块的容器中加入缓冲液，上下颠倒数次混匀，正向放置至组织块沉降，然后吸取上清并丢弃。

4.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，得到的细胞沉淀再使用缓冲液多次洗涤并离心后弃上清。

5.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，将剪碎后得到的小组织块装入容器中，并加入缓冲液，颠倒混匀数次，正向放置至组织块沉降到底部，吸取上清液，多次洗涤后合并上清液，将合并的上清液离心，去除上清，得到细胞沉淀；细胞沉淀用缓冲液洗涤，每次均离心除上清液，保留细胞沉淀。

6.根据权利要求1所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，还可以将富含精原干细胞的细胞悬液采用DNaseI处理。

7.根据权利要求1至6任一项所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，还可以将富含精原干细胞的细胞悬液采用percoll密度梯度法纯化。

8.根据权利要求7所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，采用percoll密度梯度法纯化的步骤包括：

S1、配制32.5％、30％和25％的percoll溶液，从高浓度到低浓度依次加入到容器中形成percoll密度梯度溶液；

S2、向percoll密度梯度溶液中加入所述富含精原干细胞的细胞悬液，离心，取32.5％percoll溶液以上的溶液，向其中加入缓冲液，混匀后离心取沉淀，将沉淀重悬，得到纯化后的富集精原干细胞的细胞悬液。

9.根据权利要求8所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，S2中，向percoll密度梯度溶液中加入所述富含精原干细胞的细胞悬液，800g离心30min，取32.5％percoll溶液以上的溶液，向其中加入3～10倍体积缓冲液，混匀后，200g离心取沉淀；将沉淀用缓冲液洗涤后，重悬，得到纯化后的富集精原干细胞的细胞悬液。

10.根据权利要求1至6任一项所述的机械法分离鱼类精原干细胞的方法，其特征在于，所述鱼类为罗非鱼。