[发明专利]机械法分离鱼类精原干细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及机械法分离鱼类精原干细胞的方法。该方法包括：1)用剪刀将性腺剪切成组织块，并用缓冲液洗涤；2)将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪碎成小组织块，用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀；3)将步骤2)的细胞沉淀用液体培养基重悬，过滤，得到富含精原干细胞的细胞悬液。本发明使用机械法分离得到了鱼类的精原干细胞，并且细胞损失少，杂细胞少，成功率高。本发明的机械法操作简单，对实验条件要求低，快速、成本低廉，该精原干细胞形态结构完整、纯度高、密度大，可以满足一般实验需求。

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及机械法分离鱼类精原干细胞的方法。

背景技术

生殖干细胞是性腺内的一群特殊生殖细胞，它们既可以无限增殖来维持数目相对稳定，又可以不断分化成配子，进而通过两性生殖，将遗传物质传递给子代。精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)作为一种生殖干细胞，具有高度的自我更新能力和分化潜能，能通过分裂进一步形成精子细胞，是雄性动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。

精原干细胞体外分离培养技术是研究其生物学特性、诱导分化及在转基因和种质资源保存方面应用的基础。精原干细胞的分离手段主要有酶消化法和机械分离法。机械分离法一般适用于牛、羊和猪等大动物，根据睾丸的组织特点进行分离，操作简单，成本低，但存在杂细胞多、无法得到分散的单细胞等缺陷。例如中国专利申请CN102311941A公开了一种机械法分离培养猪精原干细胞的方法，首先采用机械法将睾丸组织剪碎并用PBS洗涤，得到猪睾丸曲细精管，然后将其在明胶包被的培养瓶中培养。可以看出，该发明通过机械法得到的目的产物是曲细精管；曲细精管包括基膜，与基膜紧密连接的支持细胞，支持细胞内侧的精原干细胞，精原细胞内侧的初级精母细胞，比初级精母细胞较小的次级精母细胞，靠近管腔的精细胞(包括未发育成熟的精细胞和发育成熟的精子)等。也就是说该发明机械法得到的是一个组织，然后通过将该组织在培养液中培养，得到含有精原干细胞的培养液；很明显，该方法最终的培养液中精原干细胞的纯度会较低，实际上得到的是包含多种杂细胞的细胞团。目前还没有直接通过机械法得到纯度较高的精原干细胞的相关报道。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了机械法分离鱼类精原干细胞的方法。

本发明的技术方案如下文所示。

本发明一方面提供了一种机械法分离鱼类精原干细胞的方法，包括如下步骤：

1)用剪刀将性腺剪切成组织块，并用缓冲液洗涤；

2)将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪碎，再用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀；

3)将步骤2)的细胞沉淀用液体培养基重悬，过滤，得到富含精原干细胞的细胞悬液。

本发明中采用两步剪碎法，首先将性腺剪至半碎，并用缓冲液冲洗，可以去除大多数的血细胞和精细胞；其次将组织块进一步剪至全碎，此时，使用缓冲液洗涤，可以洗出大量的精原干细胞，将洗涤液离心后，得到细胞沉淀经过多次洗涤后，过滤，可以去除没有分散掉的组织块，进而得到富含精原干细胞的细胞悬液。本发明首次在鱼类中使用机械法得到了富集的精原干细胞，并且细胞悬液中杂细胞少，且精原干细胞密度极高。

在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，用剪刀将性腺剪切成长宽高均为0.3～1.0cm的组织块。

在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，将步骤1)洗涤后的组织块用剪刀剪成长宽高均不大于0.15cm的小组织块，用缓冲液洗涤，将洗涤得到的上清液离心取细胞沉淀。