[发明专利]一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法在审
| 申请号： | 202011173262.X | 申请日： | 2020-10-28 |
| 公开（公告）号： | CN112626110A | 公开（公告）日： | 2021-04-09 |
| 发明（设计）人： | 安梦楠;夏子豪;张崇;吴元华;赵秀香;夏博;王志平 | 申请（专利权）人： | 沈阳农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/83 | 分类号： | C12N15/83;C12N15/64 |
| 代理公司： | 北京君泊知识产权代理有限公司 11496 | 代理人： | 李丹 |
| 地址： | 110000 *** | 国省代码： | 辽宁;21 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 tmv 侵染 克隆 载体 及其 构建 方法 | ||
1.一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)病毒样品及序列的获得：首先，使用TRIzol试剂从TMV沈阳分离物(TMV-SY)侵染的新鲜烟叶中提取总RNA；其次，以所述总RNA作为模板进行反转录，得到cDNA；之后，以反转录得到的所述cDNA为模板，TMV+和TMV-为引物，使用Primestar GXL DNA聚合酶进行PCR扩增，得到长度为6395bp的DNA片段，即为TMV-SY片段，且所述TMV-SY片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
(2)二元载体pCB301的获得：以含有35S启动子的质粒pCB301作为模板，TMV3Rb+和TMV5-35S为引物进行PCR扩增，得到长度为4920bp的DNA片段，即为二元载体pCB301，且所述二元载体pCB301的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的获得：使用连接试剂盒将所述TMV-SY片段和所述二元载体pCB301进行连接，即将所述TMV-SY片段插入所述二元载体pCB301的35S启动子和35S终止子之间，构建得到一种TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY。
2.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述反转录过程是利用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒完成的。
3.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述TMV+的核苷酸序列为5’-GTATTTTTACAACAATTACC-3’，所述TMV-的核苷酸序列为5’-TGGGCCCCTACCGGGGGTAAC-3’。
4.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述TMV3Rb+的核苷酸序列为5’-TTACCCCCGGTAGGGGCCCAAAAAAAAAAAAGGGTCGGCATG-3’，所述TMV5-35S的核苷酸序列为5’-GGTAATTGTTGTAAAAATACCCCTCTCCAAATGAAATGAAC-3’。
5.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述连接试剂盒为In-Fusion HD Cloning Kits试剂盒。
6.根据权利要求1所述一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述TMV侵染性克隆载体pCB-TMV-SY的为环状结构，且所述载体pCB-TMV-SY核苷酸序列如SEQID NO.3所示，长度为11275bp。
7.一种TMV侵染性克隆载体，其特征在于，所述TMV侵染性克隆载体采用权利要求1-6所述构建方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的一种TMV侵染性克隆载体，其特征在于，所述TMV侵染性克隆载体具有完成系统侵染的能力，具有稳定性和可重复性。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于沈阳农业大学，未经沈阳农业大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/202011173262.X/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
