[发明专利]一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法

说明书

本发明提供了一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法，构建得到的TMV侵染性克隆载体为pCB‑TMV‑SY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，长度为11275bp，可应用于研究TMV与寄主植物之间的相互作用、TMV功能基因组、TMV分子检测、抗TMV药剂药效检测等方面。本发明的有益之处在于：构建方法简便、新颖，克服了酶易失活等传统双酶切构建载体方法的缺陷，构建得到侵染性克隆载体只侵染植物，对动物、人体相对安全，为研究基因合成定点突变提供了条件，实现了载体在宿主中高效表达外源蛋白、高效侵染烟草和辣椒等植物的目的，可应用于药效机理研究和效能检测等多个方面。

技术领域

本发明属于基因工程领域技术领域，涉及植物病毒侵染性克隆载体构建技术，特别涉及是一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)属于烟草花叶病毒属(genusTobamovirus)成员，TMV的基因组是单链的，编码至少4个开放阅读框(ORF)，包括126kDa和183kDa的复制酶蛋白，30kDa运动蛋白(MP)和17.5kDa外壳蛋白(CP)，该病毒寄主范围广，严重威胁着烟草，番茄，马铃薯等作物的生产，给农业生产造成了重大的经济损失。

植物RNA病毒cDNA侵染性克隆已经作为植物RNA病毒分子实验研究中的一种常用技术。是植物RNA病毒反向遗传学研究的前提和基础，对cDNA侵染性克隆进行点突变，缺失突变或插入突变可以研究病毒的基因编码策略，研究其编码基因的功能，研究基因组上非编码序列对病毒基因组RNA复制和转录的调控等，现今对于植物正义RNA病毒的广泛研究正是得益于cDNA侵染性克隆的成功构建和应用。RNA病毒cDNA侵染性克隆还可以应用于表达载体，开发植物生物反应器等。植物病毒cDNA侵染性克隆载体具有表达时间快，表达量多的特点，比转基因方法在植物体内表达外源基因更方便快捷，而且侵染性克隆的构建可使病毒在体内更加稳定不易突变，比野生型病毒更具稳定性和可重复性，现已广泛应用于药效检测等研究。

现有技术的侵染性克隆构建方式为：分别对载体和片段进行双酶切，之后再将酶切产物进行连接，进而构建获得侵染性克隆载体。这种方法虽然得到了广泛的应用，但是也存在一些无法逾越的技术缺陷，例如，操作过程复杂、繁琐，容易造成操作失误；因不可控因素导致的酶失活问题；容易出现错配，目前的载体收率低等问题。

因此，需要开发一种操作简单、构建效率高，收率高的TMV侵染性克隆载体构建方法，进而实现载体在体外的高效表达，为进一步研究TMV和寄主植物之间的相互作用、TMV功能基因组、TMV分子检测、抗TMV药剂药效检测等提供有效的工具。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种TMV侵染性克隆载体及其构建方法，该构建方法设计特异性引物首次通过一步法PCR扩增和同源重组连接的方式，以花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子为基础，以pCB301为载体，通过同源重组的方式插入TMV沈阳分离物全序列TMV-SY构建了 pCB-TMV-SY侵染性克隆载体，该载体为研究TMV和寄主植物之间的相互作用、TMV功能基因组、TMV分子检测、抗TMV药剂药效检测等提供了有效的工具。

本发明提供了一种TMV侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)病毒样品及序列的获得：首先，使用TRIzol试剂从TMV沈阳分离物(TMV-SY)侵染的新鲜烟叶中提取总RNA；其次，以所述总RNA作为模板进行反转录，得到cDNA；之后，以反转录得到的所述cDNA为模板，TMV+ 和TMV-为引物，使用Primestar GXL DNA聚合酶进行PCR扩增，得到长度为 6395bp的DNA片段，即为TMV-SY片段，且所述TMV-SY片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；