[发明专利]一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用

说明书

本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用。所述检测方法包括如下步骤：将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞混合共培养，而后加入荧光标记B对靶细胞和效应细胞进行标记，加入荧光标记C对所述共培养后产生的死细胞进行染色标记；而后分别使用不同的荧光通道对细胞进行显微成像，结合图像合成分析方法对显微图像中同一区域的细胞进行识别并分析，根据分析结果得到效应细胞的细胞杀伤效力。因此，所述检测方法可以有效排除杂质和细胞碎片的干扰，能够由图像直接得到细胞死亡率、细胞自伤率以及细胞特异杀伤率等多项数据，检测结果直观可视，准确度和灵敏度都较高。

技术领域

本发明涉及细胞杀伤活性检测技术领域，涉及一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用。

背景技术

杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的效应细胞，如自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T细胞(CTL)、具有吞噬作用的单核细胞、巨噬细胞等。

目前，细胞杀伤效力的检测方法主要包括：⁵¹Cr释放试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放法和Calcein释放实验等。其中，经典的方法是⁵¹Cr释放实验，该方法可重复性好，被视为细胞杀伤效力检测方法的“金标准”。但是因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其它替代方法进行生物学效力检测。

乳酸脱氢酶(LDH)释放法利用乳酸脱氢酶在胞质内含量丰富、正常状态下无法通过细胞膜，但是在细胞损伤或者死亡的状态下即可释放到胞外的特点，来检测效应细胞的杀伤效力。Calcein释放实验中，Calcein acetoxymethy1酯(Calcein-AM)是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共育，再加Fluoro-Quench试剂，淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔比较，计算效应细胞杀伤靶细胞百分比。

然而，不论是LDH释放法还是Calcein释放实验，都属于间接法，需要通过测定释放物质的量来进行定量，在实验过程中，反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种先进的细胞定量分析技术，其工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。但是，在检测细胞杀伤的过程中，流式分析的方法在实验阶段需要根据经验调节电压，数据分析阶段需要根据经验进行圈门，这样的过程引入了操作人和分析人的主观误差。且流式细胞仪属于液流系统，无法采集到细胞图像，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察进行佐证，这导致在需要标准化可重复验证的医疗诊断和生物医药产业化领域中，流式细胞术难以广泛使用。

因此，提供一种基于显微图像识别、直观可视并且准确的评估方法来评价细胞的杀伤活性，对于免疫细胞杀伤效力的检测以及免疫治疗相关技术的发展具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用。所述方法结合荧光显微成像和图像合成分析方法，快速、直观、准确地统计靶细胞和效应细胞的数量，并给出效应细胞杀伤效力的评价结果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞混合共培养，而后加入荧光标记B对靶细胞和效应细胞进行标记，加入荧光标记C对所述共培养后产生的死细胞进行染色标记；

其中，荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C对应的激发光波长不同；