[发明专利]一种基于细胞直径评价细胞杀伤效力的方法及其应用

说明书

本发明提供一种基于细胞直径评价细胞杀伤效力的方法及其应用。所述方法包括：将靶细胞和效应细胞混合共培养，而后得到细胞悬液，加入细胞染料对所述细胞悬液中的死细胞进行染色；对染色后的细胞进行显微成像，得到显微图像；通过图像识别对所述显微图像中的细胞进行识别，采集细胞的尺寸信息和颜色信息，并对所得信息进行分析，根据分析结果对效应细胞的细胞杀伤效力进行评价。本发明提供的方法结合明场显微成像和图像分析技术，可以直接对显微图像进行分析并获取检测结果，所得结果更加准确和直观，对于需要标准化、且需要重复验证的医疗诊断和生物医药产业化领域而言，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及细胞杀伤效力检测技术领域，具体涉及一种基于细胞直径评价细胞杀伤效力的方法及其应用。

背景技术

细胞杀伤效力评价，即细胞毒性(cytotoxicity)检测，广泛应用于生物学、临床和药学研究中。在免疫治疗中，对免疫效应细胞(immune effector cell)通过细胞杀伤效力评价来确定其细胞活力和活性是必不可少的步骤。

目前，存在较多细胞杀伤效力的评价方法，包括：MTT还原法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法、报告基因转染法、ELISPOT试验和放射性铬(51Cr)释放测定法等。其中，评估细胞杀伤效力最流行的检测方法为51Cr释放测定法，该方法被认为是检测细胞介导的细胞毒性的“金标准”，具有重复性高和相对容易执行的优点，但灵敏度低，放射性强，在总体水平检测细胞的裂解，而不是在单细胞水平上，且只能提供半定量的数据。

同时，不论是51Cr释放测定法、LDH释放法还是MTT还原法，均属于间接法测定，即都需要通过测定中间物质的量来进行定量，根据测定得到的中间物质的量间接反映活细胞和死细胞数量，在实验过程中，反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。

随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现，流式细胞术(flowcytometry，FCM)在细胞杀伤效力评价方面得到了较为明显地进步，其可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有无放射性、检测单细胞水平的细胞毒性以及评估细胞毒性过程的所有阶段等优点。但是，流式细胞仪属于液流系统，无法采集到细胞图像，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察进行佐证。同时，在检测细胞杀伤的过程中，流式分析的方法存在较多的主观误差；例如，在实验阶段，需要操作人根据经验调节电压；在数据分析阶段，需要分析人根据经验进行圈门，主观误差导致实验结果的可重复性降低。

因此，提供一种标准化、准确度高、可重复验证且实验结果直观可视的细胞杀伤效力评价方法，对于医疗诊断和生物医药产业化具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于细胞直径评价细胞杀伤效力的方法及其应用。所述方法得到的结果直观可视、准确度高，且人为的主观误差较小，可进行重复验证。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于细胞直径评价细胞杀伤效力的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将靶细胞和效应细胞混合共培养，而后得到细胞悬液，加入细胞染料对所述细胞悬液中的活细胞进行染色；

(2)对染色后的细胞进行显微成像，得到显微图像；

(3)通过图像识别对所述显微图像中的细胞进行识别，采集细胞的尺寸信息和颜色信息，并对所得信息进行分析，根据分析结果对效应细胞的细胞杀伤效力进行评价；

在所述分析的过程中，直径大于等于靶细胞最小直径且未被染色的细胞为活的靶细胞，直径大于等于靶细胞最小直径且被染色的细胞为死的靶细胞，直径小于效应细胞最大直径且未被染色的细胞为活的效应细胞，直径小于效应细胞最大直径且被染色的细胞为死的效应细胞；

其中，所述靶细胞最小直径大于等于效应细胞最大直径。