[发明专利]一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法

说明书

本发明涉及一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法，属于生物医药技术领域。本发明游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法包括如下步骤：S1、对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，然后加入反相高效液相色谱填料，进行搅拌游离吸附，使重组表皮生长因子吸附在反相高效色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；S2、用洗脱液对吸附填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组表皮生长因子浓缩液。本发明的方法工艺简便快速、步骤少、易于工业化放大等特点，产品活性、纯度均较高。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法。

背景技术

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)是广泛存在于哺乳动物体内的一类多肽物质，人表皮生长因子(hEGF)最早在1974年从人尿中提纯。hEGF是由53个氨基酸组成的小分子多肤组成，分子量约为6000道尔顿，等电点约为4.6，分子内有三对二硫键，因而对酸、碱、热等理化因素均较稳定。

hEGF是一种多功能细胞生长因子，具有广泛的生物学效应，通过与细胞膜上hEGF受体结合发挥生理作用。研究表明：表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有hEGF受体，其中表皮细胞含量最高。hEGF接近细胞后与细胞膜上的hEGEF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得RNA、DNA和蛋白质合成增加，最终促进细胞生长繁殖、加速细胞新陈代谢。hEGF在医学上己用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗。EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。

20世纪80年代以前，hEGF的来源主要是通过组织和体液提取，由于hEGF在组织和体液中的含量极微，造成提取成本高且产品纯度低，使hEGF的应用受到了限制。80年代以后，随着基因工程技术的发展，人们通过基因重组技术，利用大肠杆菌、酵母菌等生产hEGF获得了成功，为工业化生产基因重组人表皮生长因子(rhEGF)打下了基础。然而目前采用基因重组技术制得的rhEGF发酵液中的产物浓度低，提取和纯化工艺复杂，而且所获得的hEGF活性不高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法，工艺简便快速、步骤少、易于工业化放大等特点，产品活性、纯度均较高，解决了大体积发酵液进色谱柱分离带来的进样时间过长并且还会使柱压增高的问题，为进一步提取分离做了进样前的充分准备，如本发明制得的浓缩后样品可以直接进行凝胶分子筛分离。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：

一种游离吸附浓缩发酵液中重组表皮生长因子的方法，包括如下步骤：

S1、对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，然后加入反相高效液相色谱填料，进行搅拌游离吸附，使重组表皮生长因子吸附在反相高效色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；

S2、用洗脱液对吸附填料进行洗脱，并收集流岀液，即为重组表皮生长因子浓缩液。

作为优选，步骤S1所述预处理的步骤为，

1)酸沉：用酸液调节重组表皮生长因子发酵液的PH至2-3，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液；

2)加入反相高效液相色谱填料前在上清发酵液中加入终浓度为0.6～0.8mol/L的氯化钠。

作为优选，所述酸液包括稀盐酸、三氟乙酸中的一种或两种。

本发明在预处理过程中通过酸沉处理(等电点沉淀法)，将重组表皮生长因子发酵液的PH控制在2～3，能够去除重组表皮生长因子发酵液的大多数蛋白质，这是由于除重组表皮生长因子发酵液的大多数杂蛋白的等电点在都在PH3±0.5的酸性范围内。