[发明专利]一种分离鉴定黄酒中苦味多肽的方法

权利要求书

1.一种分离鉴定黄酒中苦味多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：对黄酒样品进行减压蒸馏得到难挥发组分，将难挥发组分溶解后，依次经过乙醇沉淀、正丁醇萃取、C₁₈SPE固相萃取、半制备HPLC分离得到黄酒苦味组分，再通过氨基酸组分分析、UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS、焦谷氨酸肽酶酶切多肽以及质谱软件WatersMassLynxBiolynx解析鉴定分离出黄酒中的苦味多肽；

所述乙醇沉淀包括：在溶解后的难挥发组分中加入乙醇至溶液中乙醇终浓度为80%，静置后，分离沉淀得到乙醇相和醇沉相，乙醇相除去溶剂后冷冻干燥，备用；

所述C₁₈SPE固相萃取包括：将正丁醇萃取后得到的干燥物装载至C₁₈SPE柱，依次经水、20%甲醇、80%甲醇和100%甲醇洗脱，收集80%甲醇洗脱后得到的洗脱液，除去溶剂后冷冻干燥，备用；

所述半制备HPLC分离黄酒苦味组分包括：将C₁₈SPE固相萃取后得到的干燥物溶解，进行检测，进样量为600μL，通过电子舌进行苦味强度分析，选出苦味相对强度最高的组分；其中，色谱柱：XbridgePrep C₁₈色谱柱10 mm×250 mm，5μm；流动相：A超纯水、B甲醇；洗脱条件：0minA/B 80:20，v/v，5 min A/B70:30，15min A/B70:30，16 min A/B50:50，25min A/B50:50，26 min A/B30:70, 31 min A/B30:70，32min A/B0:100，40 min A/B0:100，41minA/B80:20，45 min A/B80:20；流速：4mL/min；检测波长：272nm；

所述UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS鉴定分离出黄酒中的苦味多肽的方法包括：将上述得到的苦味相对强度最高的组分稀释到1mg/mL，色谱条件为：色谱为WatersACQUITY UPLC，检测器为WATERS ACQUITY PDA，色谱柱为BEHC₁₈反向色谱柱2.1×150 mm, 1.7 μm，洗脱条件：A乙腈、B0.1%甲酸，0min A:B2:98; 0.1 min A:B2:98; 8 min A:B40:60; 10 min A:B80:20;12 minA:B100:0;12.10 min A:B2:98，流速0.3 mL/min；PDA检测器，波长200-400nm；进样量，5μL；柱温，45℃；MS质谱条件为：电离源为电喷雾电离ESI，模式为正离子模式，毛细管电压为3500V，离子源温度为100℃，锥孔电压为20V，碰撞电压为6eV，扫描范围m/z为20-2000；MS/MS的条件为：电离源为电喷雾电离ESI，模式为正离子模式，毛细管电压为3500V，离子源温度为100℃，锥孔电压为50V，碰撞电压为55eV，扫描范围m/z为20-2000。

2.根据权利要求1所述的一种分离鉴定黄酒中苦味多肽的方法，其特征在于，所述除去溶剂的方式为减压旋转蒸发法，操作参数：真空度为-0.1MPa，温度为45℃，转速为90rpm。

3.根据权利要求1所述的一种分离鉴定黄酒中苦味多肽的方法，其特征在于，所述电子舌进行苦味强度分析包括：将冻干后的组分，溶解在100mL去离子水中，在3500rpm离心10min，取80mL上清用于电子舌检测。

4.根据权利要求1所述的一种分离鉴定黄酒中苦味多肽的方法，其特征在于，所述氨基酸组分分析通过对苦味相对强度最高的组分酸水解的方法进行测定，测定仪器为氨基酸自动分析仪L-8900。

5.根据权利要求1所述的一种分离鉴定黄酒中苦味多肽的方法，其特征在于，焦谷氨酸肽酶PGAP酶切鉴定多肽包括：将上述得到的苦味相对强度最高的组分稀释到1mg/mL，加入焦谷氨酸肽酶进行酶切处理，60℃水浴反应12h，之后10000g离心10min，取上清液，并利用UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定。

6.权利要求1~5任一所述的一种分离鉴定黄酒中苦味多肽的方法在黄酒领域的应用。