[发明专利]一种福建莲座蕨离体保存培养基及离体保存方法

说明书

本发明提供了一种福建莲座蕨离体保存培养基及离体保存方法，涉及种质保存技术领域。本发明所述离体保存培养基包括以下成分：花宝2号3g/L、NAA 0.5mg/L、蔗糖20g/L、活性炭1g/L和琼脂6g/L，pH值为5.8。利用所述离体保存培养基进行离体保存时，萌发培养15d后孢子萌发，30d后镜检孢子萌发率可达67.32％，50d左右发育成幼原叶体；将幼原叶体接种于增殖培养基中，每瓶接种4个，幼原叶体继续长大和增殖，30d继代一次，增殖率可达1:3；将原叶体团转接到离体保存培养基上，每瓶接种4个，原叶体长条形，中间厚边缘薄，原叶体团的继代周期可延长至1.5年以上。为后续莲座蕨属植物相关野生种质资源的开发、利用及保护提供理论基础和技术支持。

技术领域

本发明属于种质保存技术领域，具体涉及一种福建莲座蕨离体保存培养基及离体保存方法。

背景技术

福建莲座蕨(Angiopteris fokiensis)隶属于合囊蕨科莲座蕨，多年生草本植物，分布于浙江、福建、江西、湖北、广东、海南、广西、贵州、四川和云南等地，因其根状茎上马蹄形的宿存叶柄(基部)排成莲座状而得名。福建观音莲座株型优美，古朴挺拔，叶色青翠亮绿，具有热带风韵，其独特的莲座别具特色，具有很高的观赏价值，可用于室内盆景的观叶植物和园林绿化配植。其根状茎可食用或提取淀粉以及具有清热解毒、利湿、止痛、凉血止血等功效，在民间有较广泛的应用，而且现代植物化学与药理学研究表明，其植株含有良好药用生物活性的化合物，具有防治心脑血管、抗肿瘤、抗真菌等作用。在自然条件下，福建莲座蕨以有性繁殖为主，但配子体到孢子体诱导率低，自然种群更新速度慢。特别是近年来由于生境破坏和人为的掠夺式采掘，其野生资源濒临灭绝。开展福建莲座蕨种质资源保存方法相关研究，将对莲座蕨属植物野生种质资源的保护、开发和利用提供理论基础和技术支持。目前，关于福建莲座蕨组织培养技术进行离体保存方面未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种福建莲座蕨离体保存培养基及离体保存方法，建立福建莲座蕨离体保存体系，科学性强、实验操作简单，为后续莲座蕨属植物相关野生种质资源的开发、利用及保护提供理论基础和技术支持。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种福建莲座蕨离体保存培养基，所述离体保存培养基包括以下成分：花宝2号3g/L、NAA 0.2～0.8mg/L、蔗糖20g/L、活性炭1g/L和琼脂6g/L，pH值为5.8。

本发明还提供了所述福建莲座蕨离体保存培养基在福建莲座蕨离体保存中的应用，所述离体保存的时间为1.5年以上。

本发明还提供了一种福建莲座蕨离体保存方法，包括以下步骤：(1)收集福建莲座蕨羽片中的棕色孢子囊，灭菌后与水混合，制备孢子悬浮液；

(2)将所述孢子悬浮液接种至孢子无菌萌发培养基上进行萌发培养，得幼原叶体；所述孢子无菌萌发培养基以1/10MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L和琼脂6g/L，pH值为5.8；

(3)将所述幼原叶体接种于增殖培养基上进行增殖培养，得原叶体团；所述增殖培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L和琼脂6g/L，pH值为5.8；

(4)将所述原叶体团转接至福建莲座蕨离体保存培养基上进行离体保存；所述离体保存培养基包括以下成分：花宝2号3g/L、NAA 0.5mg/L、蔗糖20g/L、活性炭1g/L和琼脂6g/L，pH值为5.8。

优选的，步骤(1)所述收集包括：采集无病虫害且着生有棕色孢子囊但未开裂的福建莲座蕨小羽片，在解剖镜下取下完整孢子囊装入经灭菌的DNA纯化柱中，所取孢子囊数量为40个/DNA纯化柱。

优选的，步骤(1)所述灭菌包括：在无菌环境中，将收集的棕色孢子囊用体积百分含量为75％的乙醇溶液浸泡20s，再置于质量百分含量为0.2％的氯化汞水溶液中灭菌4min，无菌水漂洗4～5次。