[发明专利]一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9基因载体，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因载体是一种表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸；其中，

所述的聚多巴胺表面修饰有聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，地塞米松通过π-π共轭负载至聚多巴胺表面，聚乙烯亚胺修饰于聚多巴胺表面，透明质酸通过静电吸附作用在聚多巴胺表面；

在CRISPR/Cas9基因载体中，聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸的质量比为5：(2.5-3)：(6-7)：(5-10)。

2.一种如权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

步骤1、将浓度28％的氨水，无水乙醇与去离子水混合均匀，三者的体积比为2:40:(90～180)，20℃～40℃搅拌20-30分钟；

步骤2、将多巴胺盐酸盐溶解于去离子水中，并滴加至步骤1)中所得混合物溶液中，使得多巴胺盐酸盐的最终浓度为2～7mg/mL，20℃～40℃搅拌反应20-24小时；

步骤3、将步骤2)所得产物在12000-13000rpm下离心40～60分钟，水洗3次，得到聚多巴胺纳米粒；

步骤4、将步骤3)获得的聚多巴胺纳米粒3-6mg溶于10-20ml去离子水中并加入2.5-5mg的地塞米松粉末，搅拌24h得到聚多巴胺/地塞米松水溶液；

步骤5、将步骤4)中所得聚多巴胺/地塞米松水溶液滴加至浓度为10mg/ml聚乙烯亚胺水溶液中，聚多巴胺/地塞米松水溶液与聚乙烯亚胺水溶液的质量比为1:(1～2)搅拌20-24h；

步骤6、将步骤5)获得的反应混合物装入透析袋中，在蒸馏水中透析，得到聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液；

步骤7、将1mg/ml透明质酸的水溶液缓慢滴加到步骤6)中获得的聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液中，透明质酸的水溶液与聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液的质量比为1:(0.5～1)，搅拌反应4～6小时，得到目标产物，即上述的CRISPR/Cas9基因载体，表面经修饰的聚多巴胺纳米粒。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺为25k分子量的聚乙烯亚胺或者15k分子量的聚乙烯亚胺。

4.一种CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法基于权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因载体或者如权利要求2或3的制备方法所获得的CRISPR/Cas9基因载体；所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法包括以下步骤：

步骤1、CRISPR/Cas9基因载体的制备

通过如权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法获得CRISPR/Cas9基因载体；

步骤2、构建携带特异性sgRNA的“睡美人”转座子CRISPR/Cas9重组质粒

2.1)采用限制性内切酶剪切得到PX459质粒中的CRISPR/Cas9系统基因序列；

2.2)采用PCR方法扩增携带“睡美人”转座子的pT2BH质粒中的“睡美人”转座子基因序列；

2.3)将CRISPR/Cas9系统基因序列与“睡美人”转座子基因序列连接得到pT2SpCas9重组质粒；

2.4)将特异性sgRNA退火后插入步骤2.3)中获得的pT2SpCas9重组质粒中，得到携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒；

步骤3、CRISPR/Cas9基因载体负载携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒

将步骤2)中获得的携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒缓慢加入步骤1)中的CRISPR/Cas9基因载体的中，涡旋振荡，室温孵育20-30min即得CRISPR/Cas9系统转染复合物。

5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，步骤2.1)中所述的限制性内切酶为EcoRI和SacII。