[发明专利]一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用，其中所述的CRISPR/Cas9基因载体，其是一种表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，其中，聚多巴胺表面修饰有聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，地塞米松通过π‑π共轭负载至聚多巴胺表面，聚乙烯亚胺修饰于聚多巴胺表面，透明质酸通过静电吸附作用在聚多巴胺表面。该CRISPR/Cas9基因载体传递效率高、毒性低，生物安全性好，并且制备方法简单，条件温和，拥有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供了一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用。

技术背景

人类许多重大疾病的发生均与基因缺陷有关，包括绝大部分遗传病、镰刀型细胞贫血症、糖尿病、肿瘤等。目前传统化疗或手术治疗仍然不能有效治愈这些重大疾病，基因治疗被认为是治疗这些重大疾病的有效手段。CRISPR/Cas9基因编辑技术因高效靶向性、操作简便的优势，成为治疗基因疾病的研究热点。

常用的基因载体有两类：病毒载体与非病毒载体。目前CRISPR/Cas9系统的传递多采用慢病毒载体以提高基因的转染效率，从而确保CRISPR/Cas9系统实现其基因编辑的目的。但是慢病毒载体倾向于插入宿主基因组的高表达区域，有较强的致癌、致突变性，目前已经停止临床应用。同时病毒载体的靶向性不强，制备过程复杂，成本较高等缺陷也限制了其临床应用。非病毒载体的生物安全性与靶向性较高，但是没有基因组整合能力，转染效率较低，表达时效短，无法满足CRISPR/Cas9系统传递的需要。

本发明制备一种新型非病毒基因载体，该载体能将CRISPR/Cas9基因靶向传递至肿瘤细胞，再靶向传递至细胞核，并通过转座子将CRISPR/Cas9基因整合至宿主基因组，实现对目的基因的高效敲除。首先，将CRISPR/Cas9基因克隆至“睡美人”转座子中得到pT2SpCas9重组质粒，然后设计靶向特定基因(如：Nanog基因)的sgRNA并插入pT2SpCas9中得到pT2SpCas9-nanog重组质粒。利用睡美人转座子的转座能力，提高将目的基因插入宿主基因组的整合效率，尤其是对于难以转染的祖细胞、干细胞、生殖细胞等，使转基因表达可以稳定的遗传到子代，提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率。为了将pT2SpCas9基因靶向递送至细胞，本发明制备聚多巴胺(Polydopamine，PDA)纳米粒，在其表面修饰聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)。将地塞米松(Dexamethasone，DEX)通过π-π共轭负载至PDA表面，使载体具有细胞核靶向能力。最后通过静电吸附作用将透明质酸(Hyaluronic acid，HA)修饰在PDA表面，使载体具有肿瘤细胞靶向性，得到PDA/DEX-PEI@HA(PDPH)基因载体。该基因载体具有极低的细胞毒性和较高的转染效率，可以将pT2SpCas9重组质粒靶向传递至肿瘤细胞，并靶向传递至细胞核，再将CRISPR/Cas9基因插入细胞基因组中，对靶细胞进行高效的基因编辑。PDPH的生物安全性和转染效率远高于其他传统基因载体，是优秀的CRISPR/Cas9基因传递载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效传递CRISPR/Cas9系统的基因载体、其制备方法及应用，该基因载体可以将CRISPR/Cas9系统靶向传递至目的细胞，并传递至细胞核，再利用转座子将CRISPR/Cas9系统插入宿主基因组，提高其基因编辑的效率。该基因载体传递效率高、毒性低，生物安全性好，并且制备方法简单，条件温和，拥有广阔的应用前景。

第一方面，本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因载体，其是一种表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，其中，聚多巴胺表面修饰有聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，地塞米松通过π-π共轭负载至聚多巴胺表面，聚乙烯亚胺修饰于聚多巴胺表面，透明质酸通过静电吸附作用在聚多巴胺表面。其中，聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸的质量比为5：(2.5-3)：(6-7)：(5-10)。