[发明专利]聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法

权利要求书

1.聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)聚丙烯腈膜制备

在250mL蓝盖瓶中加入55mL二甲基甲酰胺和5mL聚乙二醇400轻轻混匀，加入10g聚丙烯腈粉末，搅拌均匀，加盖拧紧置于65℃反应，再于室温下放置24h除去气泡，倒入具有0.44mm深度槽的玻璃板上，用玻璃棒刮膜，并立即将玻璃板放入去离子水中，形成薄膜后，将薄膜放置于新的去离子水中24h以上，中间换3次水，得聚丙烯腈膜材料；

(2)游离酶液制备

将产酶菌种接种到30mL的TB培养基中，37℃、200r/min摇瓶至OD值为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，发酵18h，所得发酵液离心收集菌体，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液清洗后重悬，超声破碎离心取上清，即得海藻糖合酶酶液；

(3)海藻糖合酶固定化

取制备好的聚丙烯腈膜于烧杯中，加入去离子水超声处理20min后，去除表面水分，取30cm²面积的膜，裁剪为0.5cm²面积，放置于50mL离心管中，加入3mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液制备的海藻糖合酶酶液，在25℃水浴中吸附反应3h后，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液清洗载体，除去表面附着的游离酶，离心、抽滤即得固定化海藻糖合酶；

(4)固定化酶反应

取步骤(3)所得的固定化海藻糖合酶，加入8mL5％的麦芽糖底物，在20～60℃下反应12h，沸水煮沸10min终止反应，用HPLC法测定海藻糖的含量。

2.根据权利要求1所述的聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应40～50h至黄色均匀粘稠液体。

3.根据权利要求1所述的聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所采用的产酶菌种选自玫瑰链霉菌或节杆菌属，于25℃、200r/min条件下发酵，发酵液800r/min离心5min收集菌体。

4.根据权利要求1所述的聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH为7.6，去离子水超声处理功率为100W，频率40kHz。

5.根据权利要求1所述的聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，所述步骤(4)中高效液相色谱柱选用XBridge Amide氨基柱，流动相为乙腈：水＝80:20，流速1.0mL/min，进样量20μL，柱温为37℃，反应后的载体用缓冲液清洗除去表面水分后可再次循环使用。

6.根据权利要求1所述的聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法，其特征在于，海藻糖合酶的最佳固定化条件为；pH7.6、30℃、加酶量0.1mg/cm²条件下震荡吸附3h。