[发明专利]聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法

说明书

本发明公开了聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法。本发明以聚丙烯腈膜为载体，采用吸附法固定化海藻糖合酶，用于催化麦芽糖产海藻糖，载体材料制备方法简单、操作容易、易于控制、成本低、可规模化生产且固定化条件简单、时间短、无污染等，同时，海藻糖合酶固定化时使用粗酶液即可，无需纯化，得到的固定化海藻糖合酶具有更好的耐热性和酸碱稳定性，重复使用6次后仍能保持初始酶活的64.4％，具有良好的操作稳定性，且反应液中副产物葡萄糖的含量大大降低，固定化后海藻糖合酶更加稳定，具有十分可观的工业化应用价值。

技术领域

本发明属于酶固定化技术领域，具体涉及以聚丙烯腈膜为载体，采用吸附法固定化海藻糖合酶，用于催化麦芽糖产海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖是由两个吡喃型葡萄糖单体通过α，α-1，-1糖苷键连结而成的二糖。广泛存在于细菌、霉菌、藻类、酵母、低等植物以及些无脊椎动物等，具有独特的生物抗逆保护作用以及低甜度、非还原性等，在分子生物学、食品、化妆品、医药行业等各个领域应用广泛。海藻糖生产方法主要有化学合成法、微生物抽提法、微生物发酵法、酶法等，其中双酶法是目前工业化生产海藻糖的主要方法，但存在着酶需要精制、反应中间产物多、产物分离提取过程复杂等问题，而海藻糖合酶能够以廉价的麦芽糖为底物一步生成海藻糖，具有工艺简单、底物廉价、易于调控等特性，是工业上生产海藻糖的常见方法。但是，依然存在酶制备工艺复杂、游离酶稳定性差、不能重复利用、与底物分离困难等许多缺陷，但通过结合固定化技术可以有效解决以上不足。

目前国内外固定化海藻糖合酶的报道中以介孔分子筛、细菌纤维素、壳聚糖、磁性FeO纳米材料、Eupergit C250L为载体、多孔聚苯乙烯离子交换树脂为载体进行海藻糖合酶的固定化研究，解决了固定化酶操作稳定性及转化率等问题，但同时还存在固定化酶制备周期长、方法重复性差以及副产物含量高等问题。

聚丙烯腈是指由85％以上丙烯腈与第二、第三单体聚合而成的高聚物，具有易成膜、抗菌性、成本低以及良好的物理化学稳定性等优点，常用作工业化生产分离膜材料；同时，利用聚丙烯腈纤维上的多孔性以及弱酸性基团如羧酸根、磺酸根等可以进行吸附染色。

本发明以聚丙烯腈膜为载体，采用吸附法固定化海藻糖合酶，用于催化麦芽糖产海藻糖，载体材料制备方法简单、操作容易、易于控制、成本低、可规模化生产且固定化条件简单、时间短、无污染，能获得具有良好酶学特性的固定化海藻糖合酶，海藻糖合酶固定化时使用粗酶液，无需纯化，且反应液中副产物葡萄糖的含量大大降低，具有很可观的工业化应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供聚丙烯腈膜固定化海藻糖合酶催化麦芽糖产海藻糖的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)聚丙烯腈膜制备

在250mL蓝盖瓶中加入55mL二甲基甲酰胺和5mL聚乙二醇400轻轻混匀，加入10g聚丙烯腈粉末，搅拌均匀，加盖拧紧置于65℃反应，再于室温下放置24h除去气泡，倒入具有0.44mm深度槽的玻璃板上，用玻璃棒刮膜，并立即将玻璃板放入去离子水中，形成薄膜后，将薄膜放置于新的去离子水中24h以上，中间换3次水，得聚丙烯腈膜材料；

(2)游离酶液制备

将产酶菌种接种到30mL的TB培养基中，37℃、200r/min摇瓶至OD值为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，发酵18h，所得发酵液离心收集菌体，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液清洗后重悬，超声破碎离心取上清，即得海藻糖合酶酶液；

(3)海藻糖合酶固定化