[发明专利]油酸水合酶突变体及其在制备10-羟基硬脂酸中的应用

说明书

本发明涉及油酸水合酶突变体及其在制备10‑羟基硬脂酸中的应用，公开了一种活性及稳定性显著提高的油酸水合酶突变体，其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组油酸水合酶突变体催化剂，以及该油酸水合酶突变体或重组油酸水合酶突变体催化剂在催化油酸转化制备10‑羟基硬脂酸与10‑羰基硬脂酸中的实际应用。与现有技术相比，本发明的油酸水合酶突变体具有显著高的活性和稳定性，从而极大地减少了催化剂的用量，并且在10‑羰基硬脂酸的酶法氧化制备过程中，使用廉价的双氧水作为氧化剂，成本低，绿色环保，在10‑羰基硬脂酸的生产中将具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)来源的油酸水合酶的突变体，其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体；重组油酸水合酶突变体催化剂，还涉及油酸水合酶突变体或重组油酸水合酶突变体催化剂在制备10-羟基硬脂酸，以及与10-羟基硬脂酸脱氢酶级联制备10-羰基硬脂酸中的应用。

背景技术

油酸作为一种重要的天然产物，是典型的可再生资源，价格低廉、来源丰富。随着高纯度油酸生产技术的研发成功及高油酸植物的推广，我国油酸的生产量呈逐年增长趋势。2015年我国高纯油酸行业产量约为1.65万吨(中国油酸行业发展研究报告)，同比增长22.2％，且随着油酸市场的不断扩大，其生产规模还在不断扩大。

油酸是一种含有碳碳双键的长链脂肪酸，通过对其官能团进行修饰，可以获得10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸等产物。其中10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸可以作为精细化学品和药物等合成的化学中间体，具有较高的工业应用价值。有报道称，10-羟基硬脂酸具有有益的美容作用，可以用于治疗或预防由健康皮肤的生理体内平衡的负面发展引起的任何症状，以及促进头发生长和脱发保护，改善皮肤老年斑和明显的毛孔。

2011年，Oh等使用野生型的硝化短营养单胞菌(Stenotrophomonasnitritireducens)整细胞，在无氧条件下催化油酸水合反应，底物浓度为30g·L^-1，湿细胞上载量为20g·L^-1时，反应4h可以完全转化，而在有氧条件下4h仅可转化63％(Biotechnol.Lett.,2011,33:993-997)。2019年，许建和等挖掘到来源于Paracoccusaminophilus的油酸水合酶(简称PaOH)，在油酸浓度为90g/L，冻干酶粉上载量为5kU/L时，反应4h转化率高于95％；在此基础上，使用羟基硬脂酸脱氢酶催化水合产物10-羟基硬脂酸脱氢反应生成10-羰基硬脂酸，耦联乳酸脱氢酶催化丙酮酸氧化反应实现辅酶NAD⁺的循环再生，继续反应2h，10-羰基硬脂酸的最终生成得率为95.8％(中国专利CN110004133A)。

目前油酸水合酶的活力相对较低，由于缺乏有效的高通量筛选方法，因此活性以及稳定性改造研究较少；油酸水合酶级联羟基硬脂酸脱氢酶制备10-羰基硬脂酸的过程中，使用昂贵的丙酮酸做为辅酶循环再生的辅底物，辅酶循环成本较高，不利于其在工业上的利用。

发明内容

鉴于目前已报道的油酸水合酶活性低、稳定性差，催化反应时空产率低的缺陷，本发明建立了高效简便的油酸水合酶高通量筛选方法，从嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)来源的油酸水合酶PaOH出发，通过分子工程手段提高其活性和稳定性，得到催化性能更高的油酸水合酶突变体。在此基础上，将油酸水合酶突变体用在制备10-羟基硬脂酸中，改善了10-羟基硬脂酸酶法转化制备10-羰基硬脂酸的辅酶再生过程，有效降低了10-羰基硬脂酸的生产成本。

本发明总体目标是建立高效的高通量筛选方法，通过分子改造手段，提高油酸水合酶的活力及热稳定性，并建立较为廉价适宜的辅酶循环体系，以降低生产成本。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一，获得催化性能明显改善的油酸水合酶突变体。