[发明专利]一种重组肌肽水解酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及重组肌肽水解酶突变体，含有该酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该重组酶用于逆水解制备L‑肌肽的方法。与现有技术相比，本发明的重组肌肽水解酶突变体具有较好的热稳定性和较低的最适pH，可以直接使用相对廉价的L‑组氨酸盐酸盐作为原料催化制备L‑肌肽，并且可以达到更高的产物浓度，在L‑肌肽的生产中将具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组肌肽水解酶突变体，含有该重组肌肽水解酶突变体基因的重组表达载体及重组表达转化体，以及该重组肌肽水解酶突变体应用于L-肌肽合成的方法。

背景技术

L-肌肽又名β-丙氨酰-L-组氨酸，是由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸缩合得到的二肽，是一种白色的结晶状固体，是生物体内存在的一种天然抗氧化剂。左旋肌肽作为一种天然二肽，在动物的肌肉、脑组织、眼部晶状体组织中大量存在，浓度可高达20 mM。在生物体内，肌肽具有pH缓冲，抗氧化、抗自由基以及抗衰老等作用。在临床上，应用于减轻视觉疲劳、治疗白内障；含锌肌肽可用于治疗胃溃疡。此外肌肽及其衍生产品在食品添加剂、化妆品、保健品等领域也具有广阔的应用前景。

L-肌肽的生产有多种方法。由于肌肽在动物肌肉中含量较高，早期直接从动物组织中进行肌肽的提取，这种方式产量低，纯度差，早已被淘汰。目前通常采用的方法是化学合成法，使用邻苯二甲酸酐对丙氨酸进行氨基保护，使用二氯亚砜进行羧基活化，然后与三甲基硅烷保护的L-组氨酸反应，得到基团保护的肌肽衍生物，随后脱保护获得游离的L-肌肽。这种方法收率较高，但是反应步骤较多，反应条件比较苛刻，反应过程中需要计量消耗和生成大量对环境有害的试剂，并且邻苯二甲酰基的脱保护需要使用剧毒的试剂肼，而产品L-肌肽中不允许有肼的残留，因此对产品的提取、精制有很高的要求。总的来说，虽然化学合成法发展较早，但普遍需要复杂的保护-去保护步骤，存在着合成步骤繁琐，反应条件苛刻，产品收率低，污染大，存在有毒试剂残留等问题。

与之相比，生物合成法具有合成路线短、反应条件温和、环境友好、产物光学纯度高等优点，更适合于工业应用，将逐渐取代传统的化学合成方法。肌肽水解酶可以催化β-丙氨酸和L-组氨酸缩合生成L-肌肽，反应过程中无需对底物进行活化和保护，反应步骤少，工艺简单，效率高，唯一的副产物是水，整个过程绿色环保，因此具有很好的工业应用前景。

Ueda课题组以人脑cDNA文库为模板，克隆获得的肌肽水解酶hCN1，在酵母中进行表面展示表达，并在两相体系中使用酵母整细胞作为催化剂，催化β-丙氨酸和L-组氨酸的逆水解反应合成L-肌肽，反应体系中L-组氨酸浓度为100 mM，β-丙氨酸浓度为500 mM，产物L-肌肽的浓度仅为4.5 mM (Appl Microbiol, 2010, 86(6): 1895-1902)。许建和等利用沙雷氏菌株来源的重组肌肽水解酶SmPepD，催化合成L-肌肽，产物浓度最高达到62.5 mM(Catal Sci Technol, 2019, 9, 5971–5978)，尽管如此，由于该酶的活性相对较低，反应液中需要加入重金属锰离子，对酶进行激活，提高酶的活性。

现有报道中，肌肽水解酶品种少，催化剂活性相对较低，反应时间长，产物浓度低，不适合工业化生产要求。因此，需要筛选活性高、稳定性好，能在较短反应时间获得较高浓度产物的酶，以满足工业化生产L-肌肽的需求。

发明内容

本发明针对肌肽水解酶催化的酶法逆水解合成L-肌肽中现有技术上的不足，提供一种催化活性高、酸性pH耐受性好，稳定性好的重组肌肽水解酶突变体，含有该重组肌肽水解酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组肌肽水解酶突变体的制备方法，以及重组肌肽水解酶突变体用于合成L-肌肽的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明采用的技术方案之一：