[发明专利]一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法

权利要求书

1.含有rCod UNG水解酶的重组载体，其序列见SEQ ID NO:5。

2.一种不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备含有rCod UNG水解酶的重组载体；该载体带有His tag标签和sumo tag标签；将该重组载体导入含有pG-Tf2分子伴侣质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中；

2)诱导表达；

3)纯化：利用His tag标签对融合蛋白进行纯化，获得高纯度的rCod UNG酶。

3.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述rCod UNG水解酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；所述重组载体的序列为SEQ ID NO:5。

4.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤2中，诱导表达的培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％胰蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。

5.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述诱导表达条件为OD₆₀₀为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG,15℃，230rpm，诱导表达16h。

6.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化包括裂解菌体，融合蛋白的提取，融合蛋白的纯化步骤。

7.如权利要求6所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述裂解菌体步骤为将诱导表达所得的菌液第一次离心收集菌体，用预冷的Binding buffer重悬后，在冰水浴中超声破碎，超声结束进行第二次离心，离心完取上清进行第三次离心，取上清向其中加入聚乙烯亚胺孵育15-20min后第四次离心；

第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；

第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；

第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；

第四次离心的条件为1100g，4℃离心15min。

8.如权利要求7所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，

诱导表达菌液体积：Binding buffer的体积比为20：1；

超声破碎的功率为50％，频率为超2s停3s，时间20-25min；

所述聚乙烯亚胺:滤液的体积比为1:1000-2000，优选1:1000。

9.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白的提取步骤为，将上清加入装有Ni-NTA的蛋白提取柱，直至所有上清流过Ni-beeds；再加入与Ni-beeds等体积的Wash buffer洗去杂蛋白，重复1-2次；

再加入Elution buffer洗脱，重复洗脱4-6次，收集所有洗脱液。

10.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白的纯化为，用rCod UNG蛋白的贮存液透析两次。