[发明专利]一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法

说明书

本发明公开了一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法。该方法包括将Cod UNG的基因序列克隆到pCold‑sumo质粒构建重组质粒pCold‑sumo‑Cod UNG，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，该感受态同时转化了表达分子伴侣质粒pG‑Tf2，经低温诱导表达得到可溶性的sumo‑Cod UNG融合蛋白。本发明成功克服了Cod UNG表达产物不溶的问题。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种不耐热UNG融合蛋白的表达纯化方法。

背景技术

如今，许多临床和科学研究都依赖于在有限的样本量中对微量分析物的检测和定量，DNA和RNA的分析通常使用实时定量聚合酶链反应，数字聚合酶链反应和第二代测序。分析有限样本量的微量DNA和RNA分子(例如液体活检和单细胞)通常需要进行预扩增，以产生足够量的靶分子，对多个靶标实现可重现、特异性和灵敏的方式进行单重定量。由于这可能需要将目标序列倍增几个数量级，因此后续的样品处理将成为潜在的污染危害，其中高浓度的PCR产物可能会污染下游反应。

在PCR中，脱氧胸苷三磷酸(dTTP)可以用脱氧尿苷三磷酸(dUTP)代替。在开始PCR之前，使用尿嘧啶DNA N-糖基化酶(UNG)可以降解任何含尿嘧啶的PCR产物，即可消除残留污染物，仅扩增源自原始生物样品的含胸腺嘧啶的靶DNA。

由于传统UNG酶无法完全失活，会造成扩增子的损失因而不利于后续定量。在含有大西洋鳕鱼UNG基因修饰的重组大肠杆菌菌株中产生的Cod UNG，通过适度的热处理可以完全且不可逆地使其失活，则可避免这个问题。

在现有的UNG蛋白表达纯化方法中，常出现表达蛋白构象错误，表达量低，纯化后的UNG酶有降解和杂蛋白，酶活性低等不良结果。使得UNG酶在实际生产和运用上与理想效果存在显著差距。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种不耐热UNG融合蛋白的表达纯化方法。纯化出的UNG酶纯度高，活性强，无DNase和RNase污染，易失活对PCR无抑制作用。

为实现上述目的，本发明提供一种rCod UNG的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备含有rCod UNG蛋白的重组载体，该重组载体还带有His tag和sumo tag标签；

诱导表达

纯化：利用His tag标签对融合蛋白进行纯化，获得高纯度的rCod UNG蛋白。

进一步，所述rCod UNG蛋白的序列为SEQ ID NO:3；所述pCold-sumo载体的序列为SEQ ID NO:4。

进一步，所诱导表达的诱导培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。

进一步，所述诱导表达的条件为OD₆₀₀为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG，15℃，230rpm，培养16h诱导蛋白表达。

进一步，所述纯化包括裂解菌体，融合蛋白的提取，融合蛋白的纯化步骤。

进一步，所述裂解菌体步骤为，将诱导表达所得的菌液第一次离心收集菌体，用预冷的Binding buffer重悬后，在冰水浴中超声破碎，再第二次离心，取上清第三次离心，再次取上清，向其中加入聚乙烯亚胺(PEI)孵育15-20min后第四次离心；

优选地，第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；

优选地，第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；

优选地，第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；