[发明专利]一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)N⁶-烯丙基三磷酸腺苷或N⁴-烯丙基三磷酸胞苷标记活性RNA聚合酶位点：用未修饰的三磷酸核苷、和N⁶-烯丙基三磷酸腺苷或N⁴-烯丙基三磷酸胞苷处理带有活性RNA聚合酶的生物材料，活性RNA聚合酶将N⁶-烯丙基三磷酸腺苷或N⁴-烯丙基三磷酸胞苷引入到新生RNA中的腺嘌呤或胞嘧啶位点上，在该位点形成N⁶-烯丙基腺嘌呤或N⁴-烯丙基胞嘧啶，经过碘加成与环化处理后，形成N¹,N⁶-环化腺嘌呤或N³,N⁴-环化胞嘧啶的环化结构，屏蔽碱基互补配对；所述的带有活性RNA聚合酶的生物材料在处理前需洗掉游离的蛋白质与RNA；

(2)环化处理后的RNA的逆转录突变与测序识别：向步骤(1)获得的环化结构中加入HIV逆转录酶，RNA上的N¹,N⁶-环化腺嘌呤或N³,N⁴-环化胞嘧啶在HIV逆转录酶作用下逆转录成DNA的过程中，对位互补碱基引入发生错误，通过核酸测序手段识别突变位点，进而得到a⁶A或a⁴C位点，该位点即为新生RNA中活性RNA聚合酶的位点；

步骤(1)中，所述的生物材料为染色质、细胞核、线粒体、叶绿体、细菌；

步骤(1)中处理染色质的具体方法为，从细胞中获取活性细胞核，加入氯化钠溶液至终浓度0.5～1mol/L裂解细胞核；加入无核酸酶水，将氯化钠稀释至0.1～0.3mol/L，离心获取活性染色质；用甘油储存液溶解染色质沉淀，再加入与甘油储存液等体积的含N⁶-烯丙基三磷酸腺苷或N⁴-烯丙基三磷酸胞苷的转录重启缓冲液，16～37℃反应5～15分钟，之后用TRIzol终止反应并提取RNA；

所述的转录重启缓冲液的配置过程为：将pH＝6.0～8.0 0.5～2μmol Tris·HCl、2～30μmol氯化钾、0.5～2μmol氯化镁、0.1～0.5μmol二硫苏糖醇、1～100U RNA酶抑制剂、四种三磷酸核苷各10～100nmol和1～5％月桂酰肌氨酸钠加入无核酸酶水中，补加无核酸酶水至50～200μL备用；其中四种三磷酸核苷为ATP/a⁶ATP、GTP、CTP和UTP。

2.根据权利要求1所述的一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法，其特征在于，步骤(1)中，N⁶-烯丙基三磷酸腺苷的制备方法为：在氩气或氮气保护下，以摩尔比为1:1.5～3:3～10的6-氯嘌呤核苷、碳酸钙和烯丙基胺为原料，乙醇为溶剂，加热回流8～16小时，过滤除去不溶物，-20℃沉淀过夜，获得N⁶-烯丙基腺苷；加入摩尔量为6-氯代嘌呤核苷5～50倍的完全干燥的磷酸三甲酯、摩尔量为6-氯代嘌呤核苷1.1～2倍的三氯氧磷，0～4℃搅拌0.5～3小时至反应液完全澄清；再加入摩尔量为6-氯代嘌呤核苷2～10倍的焦磷酸三丁基胺，0～4℃搅拌10～30分钟；之后室温继续搅拌5～10分钟，加入摩尔量为6-氯代嘌呤核苷至少1千倍的三乙基碳酸氢铵终止反应；通过高效液相色谱分析提纯，得到N⁶-烯丙基三磷酸腺苷。