[发明专利]一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法及试剂盒

说明书

本发明提供一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法及试剂盒。该方法基于活性RNA聚合酶可在体外将未修饰的三磷酸核苷、N⁶‑烯丙基三磷酸腺苷(a⁶ATP)、N⁴‑烯丙基三磷酸胞苷(a⁴CTP)转录进新生RNA中，经化学处理诱导使修饰碱基在逆转录成DNA过程中发生碱基突变，然后通过核酸测序手段识别突变位点，进而得到N⁶‑烯丙基腺嘌呤(a⁶A)和N⁴‑烯丙基胞嘧啶(a⁴C)位点，该位点即为活性RNA聚合酶原本所在的位点。未突变的部分即为原有的RNA，即可得到新生RNA的丰度。本发明首次实现了在隔离的染色质中进行a⁶A、a⁴C的特异性标记，能够借助突变测序的手段进行定位，并利用一次测序获取活性聚合酶位点与RNA丰度两种信息。

技术领域

本发明属于基因测序领域，特别是一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法及试剂盒。

背景技术

RNA在生物体遗传信息的传递中起到了承上启下的作用，它的丰度直接影响了下游蛋白质的生产速率，细胞面对外界的刺激也会第一时间反映在RNA的变化中，有着极其重要的生物学功能。对RNA的研究中，针对RNA的产生的研究是其中重要的一环，也是应激反应最直接的体现。RNA在生产过程中经历了多种调控，新生RNA的变化直接反映了转录调控的多种机理。对新生RNA丰度的检测与正在进行转录的精确位置的鉴定是研究其生物学意义的前提条件。转录的精确位置在聚合酶上是活性位点(本发明中简称为RNA聚合酶位点)，在DNA上是转录位点，在RNA上是聚合位点。在转录复合物DNA-RNA-RNA聚合酶的三元复合体中三点合一，为同一位点。

目前来说，染色质RNA的丰度与活性RNA聚合酶位点是不同的测序信息，需要分别建库测序来获取。它们不同的测序方法，会导致测序中的差异，从而对研究造成干扰。目前，通过掺入5-溴尿嘧啶，然后经过免疫沉淀后建库的方式(GRO-seq)可以获取活性RNA聚合酶的位点，但分辨率仅有50碱基区域范围内，且对建库过程有极高的要求；为了提高分辨率，还将5-溴尿嘧啶换成了带生物素修饰的碱基(PRO-seq)，具体来说，就是通过掺入带生物素修饰的三磷酸核苷，使RNA聚合酶在碱基掺入处发生终止，进而免疫沉淀建库后，通过分析终止信息来确定活性RNA聚合酶的位点。尽管该方法的分辨率得到了提升，但接近转录起始位点的小RNA难以建库，造成数据损失；同时，RNA的3’端生物素的修饰导致了在后续建库过程中，连接与逆转录的效率低，这同样造成了数据的损失，因此导致了检测位点的减少。

根据以上分析可知，现有的新生RNA的高通量分析手段未获得重大突破的原因主要有三点：①不同数据难以用同种方式获取，引入新的变量；②针对活性RNA聚合酶位置的检测方式有着内在的冲突，利用对酶友好的标记方式则需要忍受较低的分辨率，利用对酶不友好的标记方式则要忍受较高的信息损失，缺乏一种两全其美的标记方式。

因此，一种新的在全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法亟待开发。

发明内容

针对现有技术中存在的缺点，本发明目的在于提供一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法及试剂盒，不同于传统利用抗体富集的方式仅能获取一种数据，亦不同于传统通过转录终止的方式得到单碱基分辨率。本发明通过突变测序的方式，无需抗体富集，可直接在全转录组范围单碱基分辨率下检测活性RNA聚合酶位点，并同时获取染色质RNA丰度。

本发明采用以下技术方案：

一种全转录组范围同时获取RNA丰度及活性RNA聚合酶位点的方法，包括以下步骤：